Candida-asszociált citokinek orális leukoplakiában

Célok

1. A candida fenotípusok, virulenciajellemzők (Szekretált aszpartil-proteinázok, biofilmképződés, foszfolipáz) és gombaellenes érzékenység klinikopatológiai jellemzői közötti összefüggés meghatározása orális leukoplakiában
2. A gyulladást elősegítő citokinek (IL-6, IL-8) szekréciójának és szintjének meghatározása. IL-17, TNFα) orális leukoplakiában a gombaellenes terápia előtt és után.
3. A candida és a gyulladást okozó citokinek közötti összefüggés vizsgálata orális leukoplakiában gombaellenes terápiával

Részletes módszertan, beleértve a vizsgálat tervezését, az eredménymutatókat, a minta méretét és a statisztikai elemzést.

Dizájnt tanulni:

Prospektív eset-kontroll megfigyelési tanulmány

A betegek kiválasztása:

A vizsgálati csoportba és a kontrollcsoportba tartozó betegeket egymás után a Dental Education & Research AIIMS Oral Medicine & Radiology klinikájáról veszik fel.

Minta nagysága:

A vizsgálat 60 OL-t (30 homogén OL-t, 30 nem homogén OL-t) és 30 egészséges kontrollt tartalmaz.

Klinopatológiai jellemzők:

A klinikai jellemzőket és a stádiumbesorolást/besorolást az egyes csoportok elkészített proforma szerint kell rögzíteni. Minden további vizsgálat előtt írásos beleegyezést kell kérni. Dohányzás, bételdió, alkoholfogyasztási szokások előzményei, gyakorisága, a szokás időtartama és jelenlegi állapota, szájban égő érzés vizuális analóg skála (VAS) pontszámokkal. A metszésbiopszia és a diagnózis hisztopatológiai megerősítése előtt rutin vérvizsgálatokat kell végezni. A H & E hisztopatológiai jellemzőket periodikus savas Schiff (PAS) festéssel rögzítik, és az Egészségügyi Világszervezet szabványos kritériumai szerint osztályozzák a vizsgálati csoportot. Az OL klinikai stádiumbesorolása az OL staging rendszer (OLEP) szerint történik (van der Waal 2000), két kalibrált megfigyelő által készített fényképfelvétellel a léziókról. Dohányról, bétel dióról és alkoholról való leszokásról szóló tanácsadás, valamint szájhigiéniai utasítások kerülnek megadásra.

Mintagyűjtemény tanulmányozáshoz:

A). Candida fenotípusok, virulencia és gombaellenes érzékenységi vizsgálat. Gyűjtés, szállítás és feldolgozás: Minden pácienstől két szájkenetet vesznek (előzetesen steril normál sóoldattal nedvesítve) a szájüregből, és elküldik a Mikrobiológiai Osztály Mikológiai Laboratóriumába további feldolgozásra a szokásos laboratóriumi eljárások szerint.

Közvetlen mikroszkópos vizsgálat: Az egyik tamponmintát mikroszkóppal megvizsgálják az élesztősejtek kimutatása céljából Gram-festés előkészítésével.

Tenyésztés: A második tampont Sabouraud dextróz agar (SDA) táptalajra oltjuk be gentamicinnel, és 37 °C-on tartjuk 48 órán keresztül. Gram-festést végeznek minden olyan szaporodáson, amely morfológiailag hasonlít az élesztő növekedéséhez.

Fenotípusos azonosítás: Az izolátumok azonosítása csíracsővel, morfológia kukoricaliszt agaron, színezés trifenil-tetrazólium-kloridon és CHROM agar táptalajon történt. Candida spp virulenciafaktorainak meghatározása Különféle virulenciafaktorok, mint foszfolipáz aktivitás, szekretált aszpartil-proteáz (SAP) és biofilm A formáció (BF) meghatározása a szabványos protokoll szerint történik.

A foszfolipáz (PL) aktivitás meghatározása A foszfolipáz aktivitást úgy mérjük, hogy a sejteket tojássárgája agar táptalajon növesztjük, és megmérjük a kicsapódási zóna méretét. 106 élesztősejt/ml koncentrációjú sóoldatos sejtszuszpenziót készítünk, és 5 μl-t a tojássárgája táptalaj felületére helyezünk. A tenyészetet ezután 37 °C-on 7-8 napig inkubáljuk, majd meghatározzuk a telep körüli csapadékzóna átmérőjét. A foszfolipáz aktivitást (Pz) úgy mérjük, hogy a telep átmérőjét elosztjuk a lemezen kialakult telep körüli csapadékzóna (pz) átmérőjével. Minden izolátumot két példányban tesztelnek. Pozitív kontrollként a C. albicans SC 5314 törzset használjuk.

A szekretált aszpartil-proteináz (SAP) aktivitás meghatározása Valamennyi izolátumot tesztelni kell a növekedésre és a szarvasmarha szérumalbumin (BSA) agar tiszta hidrolíziszónájának kialakítására. . 5 μl 1x106 sejt/ml-t szilárd táptalajra helyezünk, és 37°C-on 3-4 napig inkubáljuk. Ezt követően rögzítik az átlátszatlanságnak a kicsapódott albumin hidrolízisével történő megtisztítását. Pozitív kontrollként a C. albicans SC 5314 törzset használjuk.

Biofilm képződés (BF) meghatározása 100 μl térfogatú 1 x 106 sejt/ml szuszpenziót helyezünk steril, polisztirol, lapos fenekű 96 lyukú mikrotitráló lemezekre, és 48 órán át 37°C-on inkubáljuk a megtapadáshoz és a biofilmhez. 48 óra elteltével a lyukakat PBS-sel mossuk, és a biofilm szemi-kvalitatív mértékét XTT [2,3-bisz(2-metoxi-4-nitro-5-szulfo-fenil)-2H-tetra-zólium-5- detektálja. karboxanilid]-redukciós vizsgálat Az XTT-redukciós vizsgálat kolorimetriás változását, amely a biofilm metabolikus aktivitásának közvetlen korrelációja, ezután egy mikrotiterlemez-leolvasóval mérjük 490 nm-en 2 órás inkubáció után.

Az izolátumok gombaellenes érzékenységének vizsgálata A vorikonazollal és a klotrimazollal szembeni gombaellenes érzékenységet korongdiffúziós módszerrel kell elvégezni a CLSI M44-A2 élesztő izolátumokra vonatkozó ajánlása szerint.

B). Gyulladást elősegítő citokinek vizsgálata Mintagyűjtés a lézióból származó szájüregi váladékból Négy steril PVA szemészeti szivacsot (Merocel) használnak a szájüregi váladék mintáinak gyűjtésére négy gyulladást elősegítő citokin vizsgálathoz a szájlézióból (a biopszia helyén kívül). Ez egy nem invazív módszer, és helyspecifikussá teszi, ami előnyt jelent más szérum- és nyálbecslésekkel szemben. Ezen túlmenően, a lokális citokinszintek longitudinális mintavétellel történő értékelése OL-ban gombaellenes terápiában részesülő betegeknél lehetővé teheti a citokinemelkedés időbeli természetének és a gombaellenes szerekre adott klinikai válasznak a megértését.

Ezt az eljárást mind a vizsgálati csoport, mind a kontrollcsoport esetében elvégzik. Az alanyokat felkérik, hogy tartózkodjanak az evéstől, ivástól és a szájöblítéstől legalább 2 órával a mintavétel előtt. A szivacsokat steril normál sóoldattal előzetesen megnedvesítjük, dörzsölés vagy mozgás nélkül, vagy 1 percig érintkezésben tartják a lézióval, majd azonnal steril tartályokban tárolják -80 °C-on a további elemzésig az AIIMS biokémiai osztályán. A mintavétel helyéről a fényképes és klinikai feljegyzést a beteg proformával együtt megőrizzük későbbi hivatkozás céljából. Ezt az eljárást ugyanazon a helyen megismétlik a vizsgálati csoportban végzett gombaellenes terápia után, és összehasonlítás céljából fényképfelvételt készítenek. Az intézet etikai bizottságától etikai engedélyt kell kérni. A mintavételt megelőzően tájékozott írásos beleegyezést kell beszerezni, és a vizsgálattal kapcsolatos információkat a vizsgálati alanyok és kontrollok rendelkezésére bocsátják.

Az IL-6, IL-8, IL-17 és TNFα szintek becslése ELISA-val A szemszivacsokat (Merocel) szobahőmérsékleten 10 percig felolvasztjuk. A szivacsokat ezután egy 0,2 μm-es szűrőt (SpinX centrifugacső) tartalmazó mikrocentrifugacsőbe helyezik, 300 μl extrakciós puffer hozzáadásával egyensúlyba hoznak, és 30 percig 4 °C-on inkubálják, majd 4 °C-on 30 percig 14 000-en centrifugálják. fordulat. A centrifugálás után a kapott felülúszót összegyűjtjük az IL-6, IL-8, IL-17 és TNFα szintjének becsléséhez ELISA módszerrel, a kereskedelemben kapható kitekkel. A felülúszót felhasználásig -80 °C-on kell tárolni.

Az antigének (IL-6, IL-8, IL-17 és TNFα) elleni monoklonális antitestet előzetesen bevonták a mellékelt mikrotitercsíkok üregeire. A mintában vagy standardban jelenlévő antigéneket a lemezekkel inkubáljuk, hogy lehetővé tegyük az antigének kötődését az antitesthez. Ezt követi a biotinhoz konjugált primer monoklonális anti-IL-6, IL-8, IL-17 és TNFα antitest hozzáadása a megfelelő mikrotiterlemezeken. Ezután az elsődleges antitestre specifikus avidin-HRP konjugált antitestet adunk a lyukakba. Inkubálás és mosás után a meg nem kötött antitest enzim reagens eltávolítása érdekében egy HRP-vel reaktív TMB egylépéses szubsztrát reagenst adunk a lyukakba. A színfejlődést sav hozzáadásával leállítjuk, és az abszorbanciát 450 nm-en mérjük. A referenciagörbét úgy kapjuk meg, hogy a standard minták különböző koncentrációit az abszorbancia függvényében ábrázoljuk, és a vizsgált mintákban lévő antigének szintjeit a standard görbe alapján számítjuk ki.

Gombaellenes terápia A vizsgálati csoportot gombaellenes terápiával kezelik (100 mg flukonazol szájvízként (tabletta 10 ml ivóvízben feloldva és 2 percig öblítésként használva, majd lenyelve) naponta egyszer 14 napon keresztül). Az eljárást minden vizsgálati alanynak bemutatják a kezelés megkezdése előtt. Az orális égő érzést és a léziók klinikai jellemzőit intraorális fényképekkel rögzítjük a gombaellenes terápia után.

Statisztikai analízis:

A candida fenotípusok megoszlása, a virulencia jellemzői és a gombaellenes érzékenység a vizsgálati és a kontrollcsoportban korrelál az IL-6, IL-8, IL-17 és TNFα szintjével és a klinikopatológiai jellemzőkkel. Meg kell határozni a virulencia faktorok és a klinikai jellemzők közötti összefüggéseket. A Cohens kappa statisztikát használjuk a megfigyelőn belüli megbízhatóság meghatározására. A proinflammatorikus citokinek (IL-6, IL-8, IL-17 és TNFα) szintjének összehasonlítását a gombaellenes terápia előtt és után végezzük el a vizsgálati csoportban. Az eredményeket statisztikai szignifikancia szempontjából teszteljük. A Chi-quart és a Mann-Whitney U teszteket használjuk a csoportok közötti különbség statisztikai szignifikanciájának becslésére.

7. Etikai engedély megszerzése