呼吸器微生物叢の組成の変化

この研究は、2019 年 3 月から 12 月までの 10 か月にわたって、アル バシール公立病院から募集された患者を対象に実施されました。 すべての喘息患者は、Al Bashir 病院の外来診療所から募集されました。 研究参加者は研究の性質について知らされ、口頭および自発的に同意を得た後にのみ含まれました。 社会人口学的特徴は、すべての研究参加者から収集されました。

標本は、呼吸器疾患のサンプルを収集するための CDC ガイドラインに従って収集されました。 すべての参加者は、喀痰採取用に指定された特別な滅菌チューブで喀痰サンプルを吐き出すように求められました。 喀痰サンプルを誘導する前に、参加者に滅菌水で口をすすぐように依頼することにより、唾液および後鼻漏による喀痰サンプルの汚染を避けるために特別な注意が払われました。 次に、喀痰標本を直ちにホモジナイズし、微生物遺伝子配列決定および配列分析のための DNA 抽出のために冷凍庫 (-80°C) に保存しました。

ヨルダンの首都アンマンにあります。 DNA 抽出および 16S rRNA 配列決定 QIAamp® DNA ミニ キット (QIAGEN) を使用した DNA 抽出は、製造元の指示に従って、すべてのサンプルについて無菌室で無菌技術の下で行われました。 収集された 54 サンプル (喘息患者から 27 サンプル、健常者から 27 サンプル) の DNA 抽出物は、Molecular Research (MR DNA) ラボ (Molecular Research LP、Shallowater 、テキサス州、米国) シーケンス用。 簡単に言えば、16s rRNA 遺伝子の PCR 増幅とその後の配列決定は、イルミナを使用して行われました。 HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen、米国) を使用して、16s rRNA 遺伝子 V4 可変領域 PCR プライマー ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) とフォワード プライマーのバーコードを 30 サイクル使用しました。 増幅後、PCR産物を2%アガロースゲルでチェックして、増幅の成功とバンドの相対強度を決定しました。

次に、プールして精製した PCR 産物を使用して、Illumina DNA ライブラリーを調製しました。 シーケンスは、製造元のガイドラインに従って MiSeq で実行されました。 配列データは、MR DNA分析パイプライン（MR DNA、シャロウォーター、テキサス州、米国）を使用して処理されました。 要約すると、配列が結合され、バーコードが枯渇し、次に 150bp 未満の配列が削除され、あいまいな塩基呼び出しを持つ配列が削除されました。 配列のノイズが除去され、運用分類単位 (OTU) が生成され、キメラが削除されました。 OTU は、3% の発散 (97% の類似性) でクラスタリングすることによって定義されました。 最終的な OTU は、RDPII および NCBI から派生した精選されたデータベースに対して BLASTn を使用して分類学的に分類されました (www.ncbi.nlm.nih.gov、 http://rdp.cme.msu.edu)。 アルファ ダイバーシティ インデックス、つまりシャノン インデックス H については、データ分析バージョン 4.02 の「過去のプログラム」で、相対存在量が 1% 未満の読み取り値を除外した後に実行されました。 シャノン指数は、単一の分類群のみを持つコミュニティの 0 から、多くの分類群を持つコミュニティの高い値まで変化します (DeJong、1975)。