Hengityselinten mikrobiotan koostumuksen vaihtelut

Tutkimus kesti 10 kuukautta maaliskuusta joulukuuhun 2019 potilailla, jotka rekrytoitiin Al Bashirin julkisesta sairaalasta. Lähestyttiin sopivaa 54 osallistujan otosta (27 astmapotilasta ja 27 tervettä henkilöä). Kaikki astmapotilaat rekrytoitiin Al Bashirin sairaalan poliklinikalta. Tutkimukseen osallistuneille kerrottiin tutkimuksen luonteesta ja heidät otettiin mukaan vasta saatuaan suostumuksensa suullisesti ja vapaaehtoisesti. Sosiodemografiset ominaisuudet kerättiin kaikilta tutkimukseen osallistuneilta.

Näytteet kerättiin CDC:n hengityselinsairauksien näytteiden keräämistä koskevien ohjeiden mukaisesti. Kaikkia osallistujia pyydettiin poistamaan yskösnäyte erityisissä steriileissä putkissa, jotka oli tarkoitettu ysköksen keräämiseen. Erityistä varovaisuutta pyrittiin välttämään yskösnäytteen kontaminoituminen syljen ja nenän jälkeisen tippumisen kanssa pyytämällä osallistujia huuhtelemaan suunsa steriilillä vedellä ennen yskösnäytteen indusoimista. Sitten yskösnäyte homogenoitiin välittömästi ja säilytettiin syväpakastimessa (-80 °C) DNA:n uuttamista varten mikrobigeenien sekvensointia ja sekvenssianalyysiä varten.

sijaitsee Ammanissa, Jordanian pääkaupungissa. DNA:n uutto ja 16S rRNA:n sekvensointi DNA-uutto käyttäen QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN) suoritettiin aseptisissa tekniikoissa steriilissä huoneessa kaikille näytteille valmistajan ohjeiden mukaisesti. 54 kerätyn näytteen DNA-uutteita (27 astmapotilailta ja 27 terveiltä henkilöiltä) säilytettiin -80 °C:ssa steriileissä Eppendorf-putkissa, kunnes ne lähetettiin Molecular Research (MR DNA) -laboratorioon (Molecular Research LP, Shallowater). , TX, USA) sekvensointia varten. Lyhyesti sanottuna 16s-rRNA-geenin PCR-monistus ja sen myöhempi sekvensointi tehtiin käyttämällä Illuminaa. 16s rRNA-geenin V4 vaihtelevan alueen PCR-alukkeita ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) viivakoodilla eteenpäin suuntautuvassa alukkeessa käytettiin 30 syklissä käyttäen HotStarTaq Plus Master Mix Kit -sarjaa (Qiagen, USA). Monistamisen jälkeen PCR-tuotteet tarkistettiin 2-prosenttisessa agaroosigeelissä monistuksen onnistumisen ja vyöhykkeiden suhteellisen intensiteetin määrittämiseksi.

Yhdistetty ja puhdistettu PCR-tuote käytettiin sitten Illumina DNA -kirjaston valmistukseen. Sekvensointi suoritettiin MiSeqillä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sekvenssitiedot käsiteltiin käyttämällä MR DNA -analyysiputkea (MR DNA, Shallowater, TX, USA). Yhteenvetona voidaan todeta, että sekvenssit yhdistettiin, niistä poistettiin viivakoodit, sitten sekvenssit <150 bp poistettiin, sekvenssit, joissa oli epäselviä peruskutsuja, poistettiin. Sekvensseistä poistettiin kohinat, luotiin operatiiviset taksonomiset yksiköt (OTU) ja kimeerat poistettiin. OTU:t määritettiin klusteroimalla 3 %:n erolla (97 %:n samankaltaisuus). Lopulliset OTU:t luokiteltiin taksonomisesti käyttämällä BLASTn:ää RDPII:sta ja NCBI:sta johdettua kuratoitua tietokantaa vastaan ​​(www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Alfa-diversiteettiindeksille, nimittäin Shannon-indeksille H, se suoritettiin "Aiemmassa ohjelmassa" data-analyysiversiolle 4.02 sen jälkeen, kun lukema oli suodatettu pois suhteellisella runsaudella <1 %. Shannonin indeksi vaihtelee 0:sta yhteisöissä, joissa on vain yksi taksoni, korkeisiin arvoihin yhteisöissä, joissa on useita taksoneja (DeJong, 1975).