Variace ve složení respirační mikrobioty

Studie probíhala po dobu 10 měsíců, od března do prosince 2019, s pacienty přijatými z veřejné nemocnice Al Bashir. Byl osloven vhodný vzorek 54 účastníků (27 astmatických pacientů a 27 zdravých subjektů). Všichni astmatici byli rekrutováni z ambulance v nemocnici Al Bashir. Účastníci studie byli informováni o povaze studie a byli zařazeni až po získání jejich ústního a dobrovolného souhlasu. Sociodemografické charakteristiky byly shromážděny od všech účastníků studie.

Vzorky byly odebírány podle směrnic CDC pro odběr vzorků respiračních onemocnění. Všichni účastníci byli požádáni, aby expektorovali vzorek sputa ve speciálních sterilních zkumavkách určených pro odběr sputa. Zvláštní pozornost byla věnována tomu, aby se zabránilo kontaminaci vzorku sputa slinami a kapáním z nosu tím, že jsme požádali účastníky, aby si před indukcí vzorku sputa vypláchli ústa sterilní vodou. Poté byl expektorovaný vzorek sputa okamžitě homogenizován a uložen do hlubokého mrazáku (-80 °C) pro extrakci DNA pro mikrobiální genové sekvenování a sekvenční analýzu.

se nachází v Ammánu, hlavním městě Jordánska. Extrakce DNA a sekvenování 16S rRNA Extrakce DNA pomocí QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN) byla provedena za aseptických technik ve sterilní místnosti pro všechny vzorky podle pokynů výrobce. Extrakty DNA z 54 odebraných vzorků (27 od astmatických pacientů a 27 od zdravých subjektů) byly skladovány při -80 °C ve sterilních Eppendorfových zkumavkách, dokud nebyly odeslány do laboratoře Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) pro sekvenování. Stručně, PCR amplifikace 16s rRNA genu a jeho následné sekvenování bylo provedeno pomocí Illumina. PCR primery ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) s čárovým kódem na dopředném primeru byly použity ve 30 cyklech pomocí HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA) PCR primery 16s rRNA genu V4 variabilní oblasti PCR. Po amplifikaci byly produkty PCR zkontrolovány ve 2% agarózovém gelu, aby se stanovila úspěšnost amplifikace a relativní intenzita pásů.

Shromážděný a purifikovaný produkt PCR byl poté použit k přípravě knihovny DNA Illumina. Sekvenování bylo provedeno na MiSeq podle pokynů výrobce. Sekvenční data byla zpracována pomocí potrubí pro analýzu MR DNA (MR DNA, Shallowater, TX, USA). Stručně řečeno, sekvence byly spojeny, ochuzeny o čárové kódy, poté byly odstraněny sekvence <150bp, byly odstraněny sekvence s nejednoznačným voláním bází. Sekvence byly odšumovány, generovány operační taxonomické jednotky (OTU) a odstraněny chiméry. OTU byly definovány shlukováním při 3% divergenci (97% podobnost). Finální OTU byly taxonomicky klasifikovány pomocí BLASTn proti kurátorské databázi odvozené z RDPII a NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Pro index alfa diverzity, konkrétně Shannonův index H, byl proveden v "minulém programu" pro analýzu dat verze 4.02, po odfiltrování čtení s relativní četností <1 %. Shannonův index se pohybuje od 0 pro společenstva pouze s jedním taxonem až po vysoké hodnoty pro společenstva s mnoha taxony (DeJong, 1975).