Variationer i sammensætningen af ​​respiratorisk mikrobiota

Undersøgelsen blev gennemført over 10 måneder, fra marts til december 2019, med patienter rekrutteret fra det offentlige hospital i Al Bashir. En praktisk prøve på 54 deltagere blev kontaktet (27 astmatiske patienter og 27 raske forsøgspersoner). Alle de astmatiske patienter blev rekrutteret fra et ambulatorium på Al Bashir hospital. Undersøgelsesdeltagere blev informeret om arten af ​​undersøgelsen og blev kun inkluderet efter at have indhentet deres samtykke mundtligt og frivilligt. Sociodemografiske karakteristika blev indsamlet fra alle undersøgelsesdeltagere.

Prøver blev indsamlet i henhold til CDC-retningslinjerne for indsamling af prøver fra luftvejssygdomme. Alle deltagere blev bedt om at opspytte en sputumprøve i specielle sterile rør indiceret til sputumopsamling. Der blev taget særlig hensyn til at undgå kontaminering af sputumprøven med spyt og post-nasal drop ved at bede deltagerne om at skylle deres mund med sterilt vand, før de inducerede sputumprøven. Derefter blev den ekspektorerede sputumprøve straks homogeniseret og opbevaret i dybfryseren (-80°C) til DNA-ekstraktion til mikrobiel gensekventering og sekvensanalyse.

beliggende i Amman, Jordans hovedstad. DNA-ekstraktion og 16S rRNA-sekventering DNA-ekstraktion ved hjælp af QIAamp® DNA-minikit (QIAGEN) blev udført under aseptiske teknikker i det sterile rum for alle prøver i henhold til producentens instruktioner. DNA-ekstrakterne for de 54 indsamlede prøver (27 fra astmatiske patienter og 27 fra raske forsøgspersoner) blev opbevaret ved -80°C i et sterilt Eppendorf-rør, indtil de blev sendt til Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) til sekventering. Kort fortalt blev PCR-amplifikation af 16s rRNA-genet og dets efterfølgende sekventering udført under anvendelse af Illumina. 16s rRNA-genet V4 variabel region PCR-primere ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) med stregkode på den fremadrettede primer blev brugt i 30 cyklusser under anvendelse af HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA). Efter amplifikation blev PCR-produkter kontrolleret i 2% agarosegel for at bestemme succesen af ​​amplifikation og den relative intensitet af bånd.

Det samlede og oprensede PCR-produkt blev derefter anvendt til at fremstille Illumina DNA-biblioteket. Sekventering blev udført på en MiSeq efter producentens retningslinjer. Sekvensdata blev behandlet ved hjælp af MR DNA-analyserørledningen (MR DNA, Shallowater, TX, USA). Sammenfattende blev sekvenserne samlet, udtømt for stregkoder, derefter blev sekvenser <150bp fjernet, sekvenser med tvetydige basekald blev fjernet. Sekvenser blev denoiseret, operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) genereret og kimærer fjernet. OTU'erne blev defineret ved clustering ved 3% divergens (97% lighed). Endelige OTU'er blev taksonomisk klassificeret ved hjælp af BLASTn mod en kurateret database afledt af RDPII og NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). For alfa-diversitetsindeks, nemlig Shannon-indeks H, blev det udført i "Past Program" for dataanalyse version 4.02, efter at have filtreret aflæsningen fra med en relativ mængde på <1%. Shannon-indekset varierer fra 0 for samfund med kun et enkelt taxon til høje værdier for samfund med mange taxa (DeJong, 1975).