Вариации состава респираторной микробиоты

Исследование проводилось в течение 10 месяцев, с марта по декабрь 2019 года, с участием пациентов, набранных из государственной больницы Аль-Башир. Была выбрана удобная выборка из 54 участников (27 пациентов с астмой и 27 здоровых субъектов). Все пациенты с астмой были набраны из амбулаторной клиники больницы Аль-Башир. Участники исследования были проинформированы о характере исследования и были включены только после получения их устного и добровольного согласия. Социально-демографические характеристики были собраны у всех участников исследования.

Образцы были собраны в соответствии с рекомендациями CDC по сбору образцов респираторных заболеваний. Всем участникам было предложено отхаркивать образец мокроты в специальные стерильные пробирки, предназначенные для сбора мокроты. Особое внимание было уделено тому, чтобы избежать загрязнения образца мокроты слюной и постназальным каплями, участников просили прополоскать рот стерильной водой перед тем, как индуцировать образец мокроты. Затем образец отхаркиваемой мокроты немедленно гомогенизировали и хранили в морозильной камере (-80°C) для выделения ДНК для секвенирования микробных генов и анализа последовательности.

расположен в Аммане, столице Иордании. Выделение ДНК и секвенирование 16S рРНК Выделение ДНК с помощью мини-набора QIAamp® DNA (QIAGEN) проводили в стерильных условиях для всех образцов в соответствии с инструкциями производителя. Экстракты ДНК для 54 собранных образцов (27 от пациентов с астмой и 27 от здоровых субъектов) хранились при температуре -80°C в стерильных пробирках Эппендорфа до отправки в лабораторию молекулярных исследований (MR DNA) (Molecular Research LP, Shallowater). , Техас, США) для секвенирования. Вкратце, ПЦР-амплификацию гена 16s рРНК и его последующее секвенирование проводили с использованием Illumina. Праймеры ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) для ПЦР вариабельной области V4 гена 16s рРНК со штрих-кодом на прямом праймере использовали в 30 циклах с использованием набора HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, США). После амплификации продукты ПЦР проверяли в 2% агарозном геле для определения успешности амплификации и относительной интенсивности полос.

Затем объединенный и очищенный продукт ПЦР использовали для приготовления библиотеки ДНК Illumina. Секвенирование проводили на MiSeq в соответствии с рекомендациями производителя. Данные секвенирования обрабатывали с использованием конвейера анализа ДНК MR (MR DNA, Shallowater, TX, USA). Таким образом, последовательности были объединены, очищены от штрих-кодов, затем удалены последовательности <150 п.н., последовательности с неоднозначными базовыми вызовами были удалены. Последовательности были очищены от шума, созданы операционные таксономические единицы (OTU) и удалены химеры. OTU были определены путем кластеризации с расхождением 3% (сходство 97%). Окончательные OTU были таксономически классифицированы с использованием BLASTn на основе курируемой базы данных, полученной из RDPII и NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Для индекса альфа-разнообразия, а именно индекса Шеннона H, он был проведен в «Прошлой программе» для версии анализа данных 4.02 после фильтрации показаний с относительной численностью <1%. Индекс Шеннона варьируется от 0 для сообществ с одним таксоном до высоких значений для сообществ с большим количеством таксонов (DeJong, 1975).