Variationer i sammansättningen av respiratorisk mikrobiota

Studien genomfördes under 10 månader, från mars till december 2019, med patienter rekryterade från det offentliga sjukhuset Al Bashir. Ett bekvämt urval av 54 deltagare kontaktades (27 astmatiska patienter och 27 friska försökspersoner). Alla astmatiska patienter rekryterades från en poliklinik på Al Bashir sjukhus. Studiedeltagarna informerades om studiens natur och inkluderades först efter att ha erhållit deras samtycke muntligt och frivilligt. Sociodemografiska egenskaper samlades in från alla studiedeltagare.

Prover insamlades enligt CDC:s riktlinjer för insamling av prover för luftvägssjukdomar. Alla deltagare ombads att upphosta ett sputumprov i speciella sterila rör indikerade för sputumuppsamling. Särskild försiktighet togs för att undvika kontaminering av sputumprovet med saliv och post-nasalt dropp genom att be deltagarna att skölja munnen med sterilt vatten innan sputumprovet inducerades. Sedan homogeniserades det expektorerade sputumprovet omedelbart och förvarades i djupfrysen (-80°C) för DNA-extraktion för mikrobiell gensekvensering och sekvensanalys.

ligger i Amman, Jordaniens huvudstad. DNA-extraktion och 16S rRNA-sekvensering DNA-extraktion med QIAamp® DNA-minikit (QIAGEN) gjordes under aseptisk teknik i det sterila rummet för alla prover enligt tillverkarens instruktioner. DNA-extrakten för de 54 insamlade proverna (27 från astmatiska patienter och 27 från friska försökspersoner) förvarades vid -80°C i sterila Eppendorf-rör tills de skickades till Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) för sekvensering. Kortfattat gjordes PCR-amplifiering av 16s rRNA-genen och dess efterföljande sekvensering med hjälp av Illumina. 16s rRNA gen V4 variabel region PCR primers ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) med streckkod på den framåtriktade primern användes i 30 cykler med HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA). Efter amplifiering kontrollerades PCR-produkter i 2% agarosgel för att bestämma framgången för amplifiering och den relativa intensiteten av band.

Den sammanslagna och renade PCR-produkten användes sedan för att framställa Illumina DNA-biblioteket. Sekvensering utfördes på en MiSeq enligt tillverkarens riktlinjer. Sekvensdata bearbetades med användning av MR DNA-analyspipeline (MR DNA, Shallowater, TX, USA). Sammanfattningsvis förenades sekvenserna, utarmade på streckkoder, sedan togs sekvenser <150bp bort, sekvenser med tvetydiga basanrop togs bort. Sekvenser avbrutnas, operationella taxonomiska enheter (OTU) genererades och chimärer avlägsnades. OTU:erna definierades genom klustring vid 3% divergens (97% likhet). Slutliga OTU:er klassificerades taxonomiskt med BLASTn mot en kurerad databas härledd från RDPII och NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). För alfa-diversitetsindex, nämligen Shannon index H, utfördes det i "Past Program" för dataanalys version 4.02, efter att ha filtrerat bort avläsningen med en relativ mängd på <1%. Shannon-index varierar från 0 för samhällen med endast en enda taxon till höga värden för samhällen med många taxa (DeJong, 1975).