Variaties in de samenstelling van respiratoire microbiota

De studie werd gedurende 10 maanden uitgevoerd, van maart tot december 2019, met patiënten die werden gerekruteerd uit het openbare ziekenhuis van Al Bashir. Een geschikte steekproef van 54 deelnemers werd benaderd (27 astmapatiënten en 27 gezonde proefpersonen). Alle astmapatiënten werden gerekruteerd uit een polikliniek in het Al Bashir-ziekenhuis. Studiedeelnemers werden geïnformeerd over de aard van de studie en werden pas opgenomen nadat ze hun mondelinge en vrijwillige toestemming hadden verkregen. Sociodemografische kenmerken werden verzameld van alle studiedeelnemers.

Monsters werden verzameld volgens de CDC-richtlijnen voor het verzamelen van monsters van luchtwegaandoeningen. Alle deelnemers werd gevraagd een sputummonster op te spuwen in speciale steriele buisjes die bedoeld zijn voor het verzamelen van sputum. Er werd bijzondere aandacht besteed aan het voorkomen van besmetting van het sputummonster met het speeksel en post-neusdruppels door de deelnemers te vragen hun mond te spoelen met steriel water voordat het sputummonster werd geïnduceerd. Vervolgens werd het opgehoeste sputummonster onmiddellijk gehomogeniseerd en in de diepvriezer (-80°C) bewaard voor DNA-extractie voor microbiële gensequencing en sequentieanalyse.

gelegen in Amman, de hoofdstad van Jordanië. DNA-extractie en 16S rRNA-sequencing DNA-extractie met behulp van de QIAamp® DNA-minikit (QIAGEN) werd uitgevoerd onder aseptische technieken in de steriele ruimte voor alle monsters volgens de instructies van de fabrikant. De DNA-extracten van de 54 verzamelde monsters (27 van astmapatiënten en 27 van gezonde proefpersonen) werden bij -80 °C in steriele Eppendorf-buisjes bewaard totdat ze naar het Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowater , TX, VS) voor sequentiëring. In het kort, PCR-amplificatie van het 16s-rRNA-gen en de daaropvolgende sequentiebepaling ervan werd gedaan met behulp van Illumina. De 16s rRNA-gen V4 variabele regio PCR-primers ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) met streepjescode op de voorwaartse primer werden gebruikt in 30 cycli met behulp van de HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, VS). Na amplificatie werden PCR-producten gecontroleerd in 2% agarosegel om het succes van amplificatie en de relatieve intensiteit van banden te bepalen.

Het samengevoegde en gezuiverde PCR-product werd vervolgens gebruikt om de Illumina DNA-bibliotheek te bereiden. Sequencing werd uitgevoerd op een MiSeq volgens de richtlijnen van de fabrikant. Sequentiegegevens werden verwerkt met behulp van de MR DNA-analysepijplijn (MR DNA, Shallowater, TX, VS). Samengevat: de sequenties werden samengevoegd, ontdaan van streepjescodes, vervolgens werden sequenties <150bp verwijderd, sequenties met dubbelzinnige basisoproepen werden verwijderd. Sequenties werden ontdaan van ruis, operationele taxonomische eenheden (OTU's) gegenereerd en chimaera's verwijderd. De OTU's werden gedefinieerd door te clusteren met een divergentie van 3% (97% overeenkomst). Uiteindelijke OTU's werden taxonomisch geclassificeerd met behulp van BLASTn tegen een samengestelde database afgeleid van RDPII en NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Voor alfa-diversiteitsindex, namelijk Shannon-index H, werd deze uitgevoerd in "Past Program" voor data-analyse versie 4.02, na het uitfilteren van de meetwaarde met een relatieve overvloed van <1%. De Shannon-index varieert van 0 voor gemeenschappen met slechts één taxon tot hoge waarden voor gemeenschappen met veel taxa (DeJong, 1975).