Variações na composição da microbiota respiratória

O estudo foi realizado ao longo de 10 meses, de março a dezembro de 2019, com pacientes recrutados no hospital público Al Bashir, uma amostra conveniente de 54 participantes foi abordada (27 pacientes asmáticos e 27 indivíduos saudáveis). Todos os pacientes asmáticos foram recrutados em um ambulatório do hospital Al Bashir. Os participantes do estudo foram informados sobre a natureza do estudo e foram incluídos somente após obter seu consentimento verbal e voluntário. As características sociodemográficas foram coletadas de todos os participantes do estudo.

As amostras foram coletadas de acordo com as diretrizes do CDC para coleta de amostras de doenças respiratórias. Todos os participantes foram solicitados a expectorar uma amostra de escarro em tubos estéreis especiais indicados para coleta de escarro. Cuidados especiais foram tomados para evitar a contaminação da amostra de escarro com saliva e gotejamento pós-nasal, solicitando aos participantes que enxaguassem a boca com água estéril antes de induzir a amostra de escarro. Em seguida, a amostra de escarro expectorado foi imediatamente homogeneizada e armazenada em freezer (-80°C) para extração de DNA para sequenciamento de genes microbianos e análise de sequência.

localizado em Amã, a capital da Jordânia. Extração de DNA e sequenciamento de 16S rRNA A extração de DNA usando QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN) foi realizada sob técnicas assépticas na sala estéril para todas as amostras de acordo com as instruções do fabricante. Os extratos de DNA das 54 amostras coletadas (27 de pacientes asmáticos e 27 de indivíduos saudáveis) foram armazenados a -80° C em tubos Eppendorf estéreis até serem enviados ao Laboratório de Pesquisa Molecular (MR DNA) (Molecular Research LP, Shallowater , TX, EUA) para sequenciamento. Resumidamente, a amplificação por PCR do gene 16s rRNA e seu sequenciamento subsequente foi feito usando Illumina. Os primers de PCR de região variável V4 do gene 16s rRNA ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) com código de barras no forward primer foram usados ​​em 30 ciclos usando o HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, EUA). Após a amplificação, os produtos de PCR foram verificados em gel de agarose 2% para determinar o sucesso da amplificação e a intensidade relativa das bandas.

O produto de PCR reunido e purificado foi então usado para preparar a biblioteca de DNA Illumina. O sequenciamento foi realizado em um MiSeq seguindo as orientações do fabricante. Os dados da sequência foram processados ​​usando o pipeline de análise de DNA MR (MR DNA, Shallowater, TX, EUA). Em resumo, as sequências foram unidas, sem códigos de barras e, em seguida, as sequências <150bp removidas, as sequências com chamadas de base ambíguas foram removidas. As sequências foram removidas, unidades taxonômicas operacionais (OTUs) geradas e as quimeras removidas. As OTUs foram definidas por agrupamento em 3% de divergência (97% de similaridade). As OTUs finais foram classificadas taxonomicamente usando BLASTn contra um banco de dados curado derivado de RDPII e NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Para o índice de diversidade alfa, ou seja, índice de Shannon H, foi realizado no "Past Program" para análise de dados versão 4.02, após filtrar a leitura com abundância relativa <1%. O índice de Shannon varia de 0 para comunidades com apenas um táxon a valores altos para comunidades com muitos táxons (DeJong, 1975).