Variations de la composition du microbiote respiratoire

L'étude a été menée sur 10 mois, de mars à décembre 2019, auprès de patients recrutés à l'hôpital public Al Bashir. Un échantillon pratique de 54 participants a été approché (27 patients asthmatiques et 27 sujets sains). Tous les patients asthmatiques ont été recrutés dans une clinique externe de l'hôpital Al Bashir. Les participants à l'étude ont été informés de la nature de l'étude et n'ont été inclus qu'après avoir obtenu leur consentement verbal et volontaire. Les caractéristiques sociodémographiques ont été recueillies auprès de tous les participants à l'étude.

Les échantillons ont été prélevés conformément aux directives du CDC pour la collecte d'échantillons de maladies respiratoires. Tous les participants ont été invités à expectorer un échantillon d'expectoration dans des tubes stériles spéciaux indiqués pour la collecte des expectorations. Un soin particulier a été pris pour éviter la contamination de l'échantillon d'expectoration avec la salive et l'écoulement post-nasal en demandant aux participants de se rincer la bouche avec de l'eau stérile avant d'induire l'échantillon d'expectoration. Ensuite, l'échantillon d'expectoration expectoré a été immédiatement homogénéisé et stocké dans le congélateur (-80 ° C) pour l'extraction de l'ADN pour le séquençage des gènes microbiens et l'analyse des séquences.

situé à Amman, la capitale de la Jordanie. Extraction d'ADN et séquençage d'ARNr 16S L'extraction d'ADN à l'aide du kit QIAamp® DNA mini (QIAGEN) a été réalisée selon des techniques aseptiques dans la salle stérile pour tous les échantillons conformément aux instructions du fabricant. Les extraits d'ADN des 54 échantillons collectés (27 de patients asthmatiques et 27 de sujets sains) ont été conservés à -80°C dans des tubes Eppendorf stériles jusqu'à leur envoi au Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowwater , TX, USA) pour le séquençage. En bref, l'amplification par PCR du gène de l'ARNr 16s et son séquençage ultérieur ont été effectués à l'aide d'Illumina. Les amorces de PCR à région variable du gène V4 de l'ARNr 16s ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGGCGGCKGCTG) avec code-barres sur l'amorce directe ont été utilisées dans 30 cycles à l'aide du kit HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen, États-Unis). Après amplification, les produits de PCR ont été vérifiés dans un gel d'agarose à 2 % pour déterminer le succès de l'amplification et l'intensité relative des bandes.

Le produit de PCR regroupé et purifié a ensuite été utilisé pour préparer la bibliothèque d'ADN Illumina. Le séquençage a été effectué sur un MiSeq en suivant les directives du fabricant. Les données de séquence ont été traitées à l'aide du pipeline d'analyse d'ADN MR (MR DNA, Shallowwater, TX, USA). En résumé, les séquences ont été jointes, appauvries en codes-barres puis les séquences <150bp supprimées, les séquences avec des appels de base ambigus ont été supprimées. Les séquences ont été débruitées, les unités taxonomiques opérationnelles (OTU) générées et les chimères supprimées. Les OTU ont été définies par regroupement à 3 % de divergence (97 % de similarité). Les OTU finaux ont été classés taxonomiquement à l'aide de BLASTn par rapport à une base de données organisée dérivée de RDPII et NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Pour l'indice de diversité alpha, à savoir l'indice de Shannon H, il a été effectué dans "Past Program" pour l'analyse des données version 4.02, après filtrage de la lecture avec une abondance relative de <1 %. L'indice de Shannon varie de 0 pour les communautés avec un seul taxon à des valeurs élevées pour les communautés avec de nombreux taxons (DeJong, 1975).