Variationen in der Zusammensetzung der respiratorischen Mikrobiota

Die Studie wurde über 10 Monate von März bis Dezember 2019 mit Patienten durchgeführt, die aus dem öffentlichen Krankenhaus Al Bashir rekrutiert wurden. Es wurde eine geeignete Stichprobe von 54 Teilnehmern angesprochen (27 Asthmapatienten und 27 gesunde Probanden). Alle Asthmapatienten wurden aus einer ambulanten Klinik des Al-Bashir-Krankenhauses rekrutiert. Die Studienteilnehmer wurden über die Art der Studie aufgeklärt und erst nach Einholung ihrer mündlichen und freiwilligen Einwilligung eingeschlossen. Von allen Studienteilnehmern wurden soziodemografische Merkmale erhoben.

Die Proben wurden gemäß den CDC-Richtlinien zum Sammeln von Proben von Atemwegserkrankungen gesammelt. Alle Teilnehmer wurden gebeten, eine Sputumprobe in spezielle sterile Röhrchen zu spucken, die für die Sputumsammlung vorgesehen sind. Es wurde besonders darauf geachtet, eine Kontamination der Sputumprobe mit Speichel und postnasalem Tropf zu vermeiden, indem die Teilnehmer gebeten wurden, ihren Mund mit sterilem Wasser auszuspülen, bevor sie die Sputumprobe einführten. Dann wurde die ausgeworfene Sputumprobe sofort homogenisiert und im Tiefkühlschrank (–80°C) zur DNA-Extraktion für die mikrobielle Gensequenzierung und Sequenzanalyse gelagert.

befindet sich in Amman, der Hauptstadt Jordaniens. DNA-Extraktion und 16S-rRNA-Sequenzierung Die DNA-Extraktion mit dem QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) wurde unter aseptischen Techniken im sterilen Raum für alle Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die DNA-Extrakte der 54 entnommenen Proben (27 von Asthmapatienten und 27 von gesunden Probanden) wurden bei -80 °C in sterilen Eppendorf-Röhrchen gelagert, bis sie an das Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) zur Sequenzierung. Kurz gesagt, die PCR-Amplifikation des 16s-rRNA-Gens und seine anschließende Sequenzierung wurde unter Verwendung von Illumina durchgeführt. Die 16s-rRNA-Gen-V4-PCR-Primer der variablen Region ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) mit Strichcode auf dem Vorwärtsprimer wurden in 30 Zyklen unter Verwendung des HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA) verwendet. Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte in 2 % Agarosegel überprüft, um den Erfolg der Amplifikation und die relative Intensität der Banden zu bestimmen.

Das gepoolte und gereinigte PCR-Produkt wurde dann verwendet, um die Illumina-DNA-Bibliothek herzustellen. Die Sequenzierung wurde auf einem MiSeq gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt. Sequenzdaten wurden unter Verwendung der MR-DNA-Analyse-Pipeline (MR-DNA, Shallowater, TX, USA) verarbeitet. Zusammenfassend wurden die Sequenzen verbunden, von Strichcodes befreit, dann Sequenzen < 150 bp entfernt, Sequenzen mit zweideutigen Base Calls wurden entfernt. Sequenzen wurden entrauscht, Operational Taxonomic Units (OTUs) generiert und Chimären entfernt. Die OTUs wurden durch Clustering bei 3 % Divergenz (97 % Ähnlichkeit) definiert. Endgültige OTUs wurden taxonomisch unter Verwendung von BLASTn gegen eine kuratierte Datenbank klassifiziert, die von RDPII und NCBI abgeleitet wurde (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Für den Alpha-Diversitätsindex, nämlich den Shannon-Index H, wurde er im „Past Program“ für die Datenanalyseversion 4.02 durchgeführt, nachdem der Messwert mit einer relativen Häufigkeit von < 1 % herausgefiltert wurde. Der Shannon-Index variiert von 0 für Gemeinschaften mit nur einem Taxon bis zu hohen Werten für Gemeinschaften mit vielen Taxa (DeJong, 1975).