Variasjoner i sammensetningen av respiratorisk mikrobiota

Studien ble utført over 10 måneder, fra mars til desember 2019, med pasienter rekruttert fra Al Bashir offentlige sykehus. Et praktisk utvalg på 54 deltakere ble kontaktet (27 astmatiske pasienter og 27 friske personer). Alle de astmatiske pasientene ble rekruttert fra en poliklinikk ved Al Bashir sykehus. Studiedeltakerne ble informert om studiens natur og ble inkludert først etter å ha innhentet samtykke muntlig og frivillig. Sosiodemografiske karakteristika ble samlet inn fra alle studiedeltakerne.

Prøver ble samlet i henhold til CDC-retningslinjene for innsamling av prøver fra luftveissykdommer. Alle deltakerne ble bedt om å ekspektorere en sputumprøve i spesielle sterile rør indikert for sputuminnsamling. Spesiell forsiktighet ble tatt for å unngå kontaminering av sputumprøven med spytt og post-nasal drypp ved å be deltakerne om å skylle munnen med sterilt vann før de induserte sputumprøven. Deretter ble den ekspektorerte sputumprøven umiddelbart homogenisert og lagret i fryseren (-80°C) for DNA-ekstraksjon for mikrobiell gensekvensering og sekvensanalyse.

ligger i Amman, hovedstaden i Jordan. DNA-ekstraksjon og 16S rRNA-sekvensering DNA-ekstraksjon ved bruk av QIAamp® DNA-minisett (QIAGEN) ble utført under aseptiske teknikker i det sterile rommet for alle prøver i henhold til produsentens instruksjoner. DNA-ekstraktene for de 54 prøvene som ble samlet inn (27 fra astmatiske pasienter og 27 fra friske forsøkspersoner) ble lagret ved -80°C i et sterilt Eppendorf-rør til de ble sendt til Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) for sekvensering. Kort fortalt ble PCR-amplifisering av 16s rRNA-genet og dets påfølgende sekvensering utført ved bruk av Illumina. 16s rRNA-genet V4 variabel region PCR-primere ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) med strekkode på den fremre primeren ble brukt i 30 sykluser ved bruk av HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA). Etter amplifisering ble PCR-produktene sjekket i 2% agarosegel for å bestemme suksessen med amplifikasjon og den relative intensiteten til båndene.

Det sammenslåtte og rensede PCR-produktet ble deretter brukt til å fremstille Illumina DNA-biblioteket. Sekvensering ble utført på en MiSeq etter produsentens retningslinjer. Sekvensdata ble behandlet ved bruk av MR DNA-analyserørledningen (MR DNA, Shallowater, TX, USA). Oppsummert ble sekvensene slått sammen, tømt for strekkoder og deretter sekvenser <150bp fjernet, sekvenser med tvetydige baseanrop ble fjernet. Sekvenser ble deoisert, operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) generert og kimærer fjernet. OTU-ene ble definert ved gruppering ved 3% divergens (97% likhet). Endelige OTU-er ble taksonomisk klassifisert ved bruk av BLASTn mot en kuratert database avledet fra RDPII og NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). For alfa-diversitetsindeks, nemlig Shannon-indeks H, ble den utført i "Past Program" for dataanalyse versjon 4.02, etter å ha filtrert ut avlesningen med en relativ overflod på <1%. Shannon-indeksen varierer fra 0 for samfunn med bare et enkelt takson til høye verdier for samfunn med mange taxa (DeJong, 1975).