Variazioni nella composizione del microbiota respiratorio

Lo studio è stato condotto nell'arco di 10 mesi, da marzo a dicembre 2019, con pazienti reclutati dall'ospedale pubblico di Al Bashir, è stato contattato un campione conveniente di 54 partecipanti (27 pazienti asmatici e 27 soggetti sani). Tutti i pazienti asmatici sono stati reclutati da una clinica ambulatoriale dell'ospedale Al Bashir. I partecipanti allo studio sono stati informati sulla natura dello studio e sono stati inclusi solo dopo aver ottenuto il loro consenso verbale e volontario. Le caratteristiche sociodemografiche sono state raccolte da tutti i partecipanti allo studio.

I campioni sono stati raccolti secondo le linee guida CDC per la raccolta di campioni di malattie respiratorie. A tutti i partecipanti è stato chiesto di espettorare un campione di espettorato in appositi tubi sterili indicati per la raccolta dell'espettorato. Particolare cura è stata prestata per evitare la contaminazione del campione di espettorato con la saliva e il gocciolamento post-nasale chiedendo ai partecipanti di sciacquarsi la bocca con acqua sterile prima di indurre il campione di espettorato. Quindi il campione di espettorato espettorato è stato immediatamente omogeneizzato e conservato nel congelatore (-80°C) per l'estrazione del DNA per il sequenziamento del gene microbico e l'analisi della sequenza.

situato ad Amman, la capitale della Giordania. Estrazione del DNA e sequenziamento dell'rRNA 16S L'estrazione del DNA utilizzando il mini kit QIAamp® DNA (QIAGEN) è stata eseguita con tecniche asettiche in una stanza sterile per tutti i campioni secondo le istruzioni del produttore. Gli estratti di DNA per i 54 campioni raccolti (27 da pazienti asmatici e 27 da soggetti sani) sono stati conservati a -80° C in provette Eppendorf sterili fino a quando non sono stati inviati al Molecular Research (MR DNA) Lab (Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) per il sequenziamento. In breve, l'amplificazione PCR del gene rRNA 16s e il suo successivo sequenziamento sono stati eseguiti utilizzando Illumina. I primer PCR della regione variabile V4 del gene rRNA 16s ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) con codice a barre sul primer forward sono stati utilizzati in 30 cicli utilizzando il kit HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen, USA). Dopo l'amplificazione, i prodotti PCR sono stati controllati in gel di agarosio al 2% per determinare il successo dell'amplificazione e l'intensità relativa delle bande.

Il prodotto PCR riunito e purificato è stato quindi utilizzato per preparare la libreria di DNA Illumina. Il sequenziamento è stato eseguito su un MiSeq seguendo le linee guida del produttore. I dati di sequenza sono stati elaborati utilizzando la pipeline di analisi del DNA MR (MR DNA, Shallowater, TX, USA). In sintesi, le sequenze sono state unite, prive di codici a barre, quindi le sequenze <150 bp rimosse, le sequenze con identificazioni di basi ambigue sono state rimosse. Le sequenze sono state denoizzate, le unità tassonomiche operative (OTU) generate e le chimere rimosse. Le OTU sono state definite raggruppando al 3% di divergenza (97% di somiglianza). Le OTU finali sono state classificate tassonomicamente utilizzando BLASTn rispetto a un database curato derivato da RDPII e NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Per l'indice di diversità alfa, vale a dire l'indice di Shannon H, è stato eseguito in "Past Program" per l'analisi dei dati versione 4.02, dopo aver filtrato la lettura con abbondanza relativa <1%. L'indice di Shannon varia da 0 per le comunità con un solo taxon a valori elevati per le comunità con molti taxa (DeJong, 1975).