Változások a légúti mikrobiota összetételében

A vizsgálatot 10 hónapon keresztül, 2019 márciusa és decembere között végezték, az Al Bashir állami kórházból toborzott betegek bevonásával. 54 résztvevőből álló kényelmes mintát kerestek meg (27 asztmás beteg és 27 egészséges alany). Az összes asztmás beteget az Al Bashir kórház járóbeteg-klinikájáról vették fel. A vizsgálatban résztvevők tájékoztatást kaptak a vizsgálat természetéről, és csak a szóbeli és önkéntes beleegyezésük megszerzése után kerültek bevonásra. A szociodemográfiai jellemzőket a vizsgálat összes résztvevőjétől gyűjtöttük.

A mintákat a CDC légúti betegségek mintavételére vonatkozó irányelvei szerint gyűjtöttük. Minden résztvevőt arra kértek, hogy köptessen ki köpetmintát speciális, köpetgyűjtésre alkalmas steril csövekbe. Különös gondot fordítottak arra, hogy elkerüljük a köpetminta nyállal és orr utáni csepegtetővel való szennyeződését, mivel megkérték a résztvevőket, hogy a köpetminta indukálása előtt öblítsék ki a szájukat steril vízzel. Ezután a köptetett köpetmintát azonnal homogenizáltuk, és mélyhűtőben (-80°C) tároltuk DNS-kinyerés céljából mikrobiális génszekvenáláshoz és szekvencia analízishez.

Jordánia fővárosában, Ammanban található. DNS-kivonás és 16S rRNS-szekvenálás A DNS-kivonás QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN) használatával aszeptikus technikák mellett, steril helyiségben történt minden minta esetében a gyártó utasításai szerint. Az 54 minta DNS-kivonatait (27 asztmás betegektől és 27 egészséges alanyoktól) -80 °C-on tároltuk steril Eppendorf-csövekben, amíg el nem küldték a Molecular Research (MR DNS) Laboratóriumba (Molecular Research LP, Shallowater). , TX, USA) a szekvenáláshoz. Röviden, a 16s rRNS gén PCR-amplifikációját és az azt követő szekvenálást Illumina segítségével végeztük. A 16s rRNS gén V4 variábilis régiójának PCR primerjeit ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) vonalkóddal a forward primeren 30 ciklusban használták a HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA) segítségével. Az amplifikáció után a PCR termékeket 2%-os agaróz gélben ellenőriztük, hogy meghatározzuk az amplifikáció sikerességét és a sávok relatív intenzitását.

Az egyesített és tisztított PCR-terméket ezután felhasználtuk az Illumina DNS-könyvtár elkészítésére. A szekvenálást MiSeq-en végeztük a gyártó útmutatásait követve. A szekvenciaadatokat MR DNS-elemző pipeline (MR DNA, Shallowater, TX, USA) segítségével dolgoztuk fel. Összefoglalva, a szekvenciákat egyesítettük, kimerítettük a vonalkódokat, majd a 150 bp-nál kisebb szekvenciákat eltávolítottuk, a kétértelmű bázishívásokkal rendelkező szekvenciákat eltávolítottuk. A szekvenciák zajtalanításra kerültek, operatív taxonómiai egységek (OTU) jöttek létre, és a kimérákat eltávolították. Az OTU-kat 3%-os eltérésnél (97%-os hasonlóság) klaszterezéssel határoztuk meg. A végső OTU-kat taxonómiailag a BLASTn segítségével osztályozták, összehasonlítva az RDPII-ből és az NCBI-ból származó kurált adatbázissal (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Az alfa-diverzitási index, nevezetesen a Shannon-index H esetében a 4.02-es verziójú adatelemzési "Past Program"-ban történt, miután kiszűrtük az <1%-os relatív abundanciájú leolvasást. A Shannon-index az egyetlen taxont tartalmazó közösségek 0-tól a sok taxont tartalmazó közösségek magas értékéig terjed (DeJong, 1975).