Zmiany w składzie mikrobiomu oddechowego

Badanie przeprowadzono przez 10 miesięcy, od marca do grudnia 2019 r., z pacjentami rekrutowanymi ze szpitala publicznego Al Bashir. Zbliżono się do dogodnej próby 54 uczestników (27 pacjentów z astmą i 27 osób zdrowych). Wszyscy pacjenci z astmą byli rekrutowani z ambulatorium szpitala Al Bashir. Uczestnicy badania zostali poinformowani o charakterze badania i zostali włączeni do niego dopiero po uzyskaniu ustnej i dobrowolnej zgody. Od wszystkich uczestników badania zebrano cechy socjodemograficzne.

Próbki pobierano zgodnie z wytycznymi CDC dotyczącymi pobierania próbek chorób układu oddechowego. Wszyscy uczestnicy zostali poproszeni o odkrztuszanie próbki plwociny do specjalnych sterylnych probówek przeznaczonych do pobierania plwociny. Szczególną uwagę zwrócono na uniknięcie zanieczyszczenia próbki plwociny śliną i kroplówką donosową, prosząc uczestników o przepłukanie ust sterylną wodą przed wywołaniem próbki plwociny. Następnie próbkę wykrztuśnej plwociny natychmiast homogenizowano i przechowywano w głębokiej zamrażarce (-80°C) w celu ekstrakcji DNA w celu sekwencjonowania genów drobnoustrojów i analizy sekwencji.

w Ammanie, stolicy Jordanii. Ekstrakcję DNA i sekwencjonowanie 16S rRNA Ekstrakcję DNA przy użyciu zestawu QIAamp® DNA mini (QIAGEN) przeprowadzono z zachowaniem zasad aseptyki w sterylnym pomieszczeniu dla wszystkich próbek zgodnie z instrukcjami producenta. Ekstrakty DNA z 54 zebranych próbek (27 od pacjentów z astmą i 27 od osób zdrowych) przechowywano w temperaturze -80°C w sterylnych probówkach Eppendorfa do czasu wysłania ich do Laboratorium Badań Molekularnych (MR DNA) (Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) do sekwencjonowania. Pokrótce, amplifikację PCR genu 16s rRNA i jego późniejsze sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu Illumina. Startery PCR regionu zmiennego V4 genu 16s rRNA ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) z kodem kreskowym na starterze przednim zastosowano w 30 cyklach przy użyciu zestawu HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA). Po amplifikacji produkty PCR sprawdzano w 2% żelu agarozowym w celu określenia powodzenia amplifikacji i względnej intensywności prążków.

Połączone i oczyszczone produkty PCR zastosowano następnie do przygotowania biblioteki DNA Illumina. Sekwencjonowanie przeprowadzono na MiSeq zgodnie z wytycznymi producenta. Dane sekwencji przetwarzano przy użyciu potoku analizy DNA MR (MR DNA, Shallowater, TX, USA). Podsumowując, sekwencje połączono, pozbawiono kodów kreskowych, a następnie usunięto sekwencje <150 pz, usunięto sekwencje z niejednoznacznymi wywołaniami zasad. Sekwencje zostały odszumione, wygenerowano operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) i usunięto chimery. OTU zostały zdefiniowane przez grupowanie przy 3% rozbieżności (97% podobieństwa). Ostateczne OTU zostały sklasyfikowane taksonomicznie przy użyciu BLASTn w stosunku do wyselekcjonowanej bazy danych pochodzącej z RDPII i NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Dla indeksu różnorodności alfa, czyli indeksu Shannona H, przeprowadzono go w „Past Program” dla wersji analizy danych 4.02, po odfiltrowaniu odczytu o względnej obfitości <1%. Indeks Shannona waha się od 0 dla zbiorowisk z tylko jednym taksonem do wysokich wartości dla zbiorowisk z wieloma taksonami (DeJong, 1975).