呼吸微生物群组成的变化

该研究从 2019 年 3 月到 2019 年 12 月进行了 10 多个月，从 Al Bashir 公立医院招募患者，接触了 54 名参与者的方便样本（27 名哮喘患者和 27 名健康受试者）。 所有哮喘患者都是从 Al Bashir 医院的门诊诊所招募的。 研究参与者被告知研究的性质，并且只有在获得他们的口头和自愿同意后才会被纳入。 从所有研究参与者那里收集社会人口学特征。

标本是根据疾病预防控制中心收集呼吸道疾病样本的指南收集的。 所有参与者都被要求在专门用于收集痰液的无菌试管中咳出痰液样本。 通过要求参与者在诱导痰液样本之前用无菌水漱口，特别注意避免唾液和鼻后滴液污染痰液样本。 然后将咳出的痰液标本立即匀浆并保存在低温冰箱（-80℃）中，用于微生物基因测序和序列分析的DNA提取。

位于约旦首都安曼。 DNA 提取和 16S rRNA 测序 使用 QIAamp® DNA 迷你试剂盒 (QIAGEN) 的 DNA 提取是根据制造商的说明在无菌室中以无菌技术对所有样品进行的。 将收集到的 54 个样本（27 个来自哮喘患者和 27 个来自健康受试者）的 DNA 提取物储存在 -80°C 的无菌 Eppendorf 管中，直到它们被送到分子研究 (MR DNA) 实验室（Molecular Research LP, Shallowater , TX, USA) 进行测序。 简而言之，使用 Illumina 完成 16s rRNA 基因的 PCR 扩增及其后续测序。 16s rRNA 基因 V4 可变区 PCR 引物 ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) 在正向引物上带有条形码，使用 HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, USA) 在 30 个循环中使用。 扩增后，PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行检查，以确定扩增是否成功和条带的相对强度。

然后将合并和纯化的 PCR 产物用于制备 Illumina DNA 文库。 按照制造商的指南在 MiSeq 上进行测序。 使用 MR DNA 分析管道（MR DNA，Shallowater，TX，USA）处理序列数据。 总之，序列被连接，条形码耗尽，然后序列 <150bp 被移除，具有不明确碱基调用的序列被移除。 对序列进行去噪、生成操作分类单元 (OTU) 并移除嵌合体。 OTU 是通过以 3% 的差异（97% 的相似性）进行聚类来定义的。 使用 BLASTn 针对源自 RDPII 和 NCBI 的精选数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov， http://rdp.cme.msu.edu）。 对于alpha多样性指数，即香农指数H，是在4.02版数据分析的“Past Program”中进行的，过滤掉相对丰度<1%的读数后。 香农指数从仅具有单一分类单元的群落的 0 到具有多个分类单元的群落的高值不等（DeJong，1975）。