Variaciones en la Composición de la Microbiota Respiratoria

El estudio se realizó durante 10 meses, de marzo a diciembre de 2019, con pacientes reclutados del hospital público Al Bashir. Se abordó una muestra conveniente de 54 participantes (27 pacientes asmáticos y 27 sujetos sanos). Todos los pacientes asmáticos fueron reclutados de una clínica ambulatoria en el hospital Al Bashir. Los participantes del estudio fueron informados sobre la naturaleza del estudio y fueron incluidos solo después de obtener su consentimiento verbal y voluntario. Se recogieron las características sociodemográficas de todos los participantes del estudio.

Las muestras se recolectaron de acuerdo con las pautas de los CDC para recolectar muestras de enfermedades respiratorias. Se pidió a todos los participantes que expectoraran una muestra de esputo en tubos estériles especiales indicados para la recolección de esputo. Se tuvo especial cuidado para evitar la contaminación de la muestra de esputo con la saliva y el goteo posnasal al pedir a los participantes que se enjuagaran la boca con agua esterilizada antes de inducir la muestra de esputo. Luego, la muestra de esputo expectorado se homogeneizó inmediatamente y se almacenó en un congelador profundo (-80 °C) para la extracción de ADN para la secuenciación de genes microbianos y el análisis de secuencias.

ubicado en Amman, la ciudad capital de Jordania. Extracción de ADN y secuenciación de ARNr 16S La extracción de ADN con el mini kit de ADN QIAamp® (QIAGEN) se realizó bajo técnicas asépticas en la sala estéril para todas las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los extractos de ADN de las 54 muestras recolectadas (27 de pacientes asmáticos y 27 de sujetos sanos) se almacenaron a -80 °C en tubos Eppendorf estériles hasta que se enviaron al Laboratorio de Investigación Molecular (ADN MR) (Molecular Research LP, Shallowater , TX, EE. UU.) para la secuenciación. Brevemente, la amplificación por PCR del gen 16s rRNA y su posterior secuenciación se realizó utilizando Illumina. Los cebadores de PCR de región variable V4 del gen 16s rRNA ill27Fmod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) /ill519Rmod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) con código de barras en el cebador directo se usaron en 30 ciclos usando el HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, EE. UU.). Después de la amplificación, los productos de PCR se verificaron en gel de agarosa al 2% para determinar el éxito de la amplificación y la intensidad relativa de las bandas.

El producto de PCR agrupado y purificado se usó luego para preparar la biblioteca de ADN de Illumina. La secuenciación se realizó en un MiSeq siguiendo las pautas del fabricante. Los datos de secuencia se procesaron utilizando la canalización de análisis de ADN de MR (MR DNA, Shallowater, TX, EE. UU.). En resumen, las secuencias se unieron, se agotaron los códigos de barras y luego se eliminaron las secuencias de <150 pb, se eliminaron las secuencias con llamadas de bases ambiguas. Se eliminó el ruido de las secuencias, se generaron unidades taxonómicas operativas (OTU) y se eliminaron las quimeras. Las OTU se definieron mediante la agrupación en 3% de divergencia (97% de similitud). Las OTU finales se clasificaron taxonómicamente usando BLASTn contra una base de datos seleccionada derivada de RDPII y NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rdp.cme.msu.edu). Para el índice de diversidad alfa, es decir, el índice de Shannon H, se llevó a cabo en "Past Program" para el análisis de datos versión 4.02, después de filtrar la lectura con abundancia relativa de <1%. El índice de Shannon varía de 0 para comunidades con un solo taxón a valores altos para comunidades con muchos taxones (DeJong, 1975).