子宮洗浄EHUD研究とデュプレックスシーケンスを使用した高悪性度卵巣がんの早期発見 (EHUD)

アプローチフェーズ I ワシントン大学は、原理の診断的証明を実証しました。ただし、産業規模の展開には、さらなる最適化と検証が必要です。 フェーズ I では、UtL ろ過法が最適化され (目的 1)、商用ワークフローでの分析性能が検証され (目的 2)、サンプル収集のマイルストーンが達成されます (目的 3)。 目的 1. 腫瘍由来 DNA の濃縮を最大化するための子宮洗浄ろ過の有用性を判断します。 2つのサンプルを使用した予備試験では、UtLをろ過して子宮内膜細胞のクラスターを除去すると、腫瘍変異に対する感度が数倍向上する可能性があることが示されました。 このデータセットは、既知の TP53 変異を持つ HGSC 患者からの 10 個の UtL のろ過効果を分析することによって拡張されます。 各 UtL は半分に分割されます。前半はフィルタリングされ、後半はフィルタリングされません。 DNA は、フィルター処理、フィルター処理、およびフィルター処理されていない画分から抽出され、TP53 DS (合計 30 サンプル) によって分析されます。 各 UtL について、各画分の DNA 収量と腫瘍変異の MAF を比較します。 ろ過された画分は、ろ過されていない画分よりも少ない DNA を含むことが予想されますが、腫瘍変異はより高い頻度で存在します。 感度が改善された場合 (つまり、利用可能な DNA の減少によって失われるよりも濃縮によって得られるものが多い場合)、収集される今後のすべてのサンプルに対してろ過が使用されます。 目的 2. 最適化されたアッセイの検証: 精度、精度、検出限界、および再現性。 TwinStrand は、改善されたアダプター、ライゲーション ケミストリー、およびリキッド ハンドリング ロボットに適し、CLIA ラボ基準に適合する高スループット 96 ウェル プレートベースのフォーマットを使用して、合理化された DS ワークフローを開発しました。

TwinStrand は、複数のサンプルの自動並列処理をサポートする、最適化されたクラウドベースの分析パイプラインも開発しました。 UtL サンプルで TP53 変異を検出するための最適化されたプロセスが検証されます。 精度、技術的精度、および検出の下限を評価するために、TP53 内またはその近くの 5 つ以上の SNP サイトで遺伝子型が異なる 2 人の個人からの DNA サンプルを、1:100 1:5,000、2 UtL の比率で混合します。 混合物は、2 つの独立した実験で ~ 10,000 倍の分子深度でシーケンスされます。 SNP 対立遺伝子分画 (AF) を異なる希釈で比較して、精度 (予想される AF と観測された AF)、精度 (複製間の AF 変動)、および達成可能な検出の下限を決定します。 意図した臨床使用におけるアッセイの再現性をテストするために、Aim 1 で使用される 30 のサンプルでシーケンスが繰り返されます。これには、広範囲の腫瘍 MAF が含まれます。 スポンサーは、複製間の変動係数を計算します。 パイロット研究に基づき、スポンサーは優れた再現性 (CV<5%) を期待しています。 目的 3. サンプルの収集。 フェーズ II で提案されたサンプルの収集は、各参加機関での適切な IRB/倫理委員会の承認の下で開始されます。

収集後、サンプルはウィーン医科大学の癌研究所に送られ、そこで UtL ろ過と DNA 抽出が行われます。

パパニコロウ塗抹標本および末梢白血球からのペア DNA も抽出されます。 分離された DNA には識別番号が割り当てられ、Duplex Sequencing のために TwinStrand に送られます。

フェーズ I のマイルストーン:

1. 腫瘍変異濃縮における UtL ろ過の有用性を確認します。
2. 合理化されたアッセイの精度、精度、検出下限、再現性を UtL で定量化します。
3. フェーズ II のサンプル収集を開始します。

フェーズ I 製品:

1. DS ワークフローは、フェーズ II およびフェーズ III の商業規模で UtL DNA に適用する準備ができています。
2. フェーズ II のサンプルバンク

アプローチ フェーズ II フェーズ II では、平均および高リスク集団の両方を含む拡張症例対照患者コホートにおける早期卵巣癌検出のための UtL での TP53 DS の使用を検証します。 TP53 変異頻度の感度と特異性に影響を与える可能性のある事前定義されたパラメーターが調べられ、統計的にモデル化されます。 臨床感度と特異性は、多変量の臨床特性、および白血球配列決定に基づく各個人の固有のバックグラウンド変異負荷を使用して、パーソナライズされた診断しきい値統計モデルを構築することによって最大化されます。 患者のサブセットでは、パップスミア サンプリングよりも優れた UtL のパフォーマンスが確認されます。 さらに、UtL および対応する腫瘍組織/STIC の HGSC に関連する 96 のメチル化マーカーのセットを研究するために、含まれる患者のサブセットで概念実証研究が実施されます。

目的 1. 一般集団の卵巣がんスクリーニング この目的は、平均リスク集団における HGSC 検出のバイオマーカーを開発することです。 スポンサーは、最大の感度と特異性で HGSC の女性を特定するために、TP53 DS 変異データを臨床病理学的情報と統合する症例対照研究を実施します。 HGSC の 98% 以上が TP53 に変異を持っています。つまり、非常に深い DS は、わずかなゲノム領域に焦点を当てた費用対効果の高い方法です。 この目標の成果物は、200 人の患者のバイオマーカー データ セットであり、この非常に必要とされている卵巣がん診断の費用対効果が高く、商業的に堅牢なパフォーマンスを示します。

目的 1A: 平均リスク患者における HGSC 検出のための UtL での TP53 DS の試験性能を評価すること。

方法: 平均リスク集団からの 200 人の被験者からの UtL サンプルが DS を介して分析されます: HGSC を持つ 100 人の被験者 (ケース) と、切除後に最終的に良性であることが判明した病変を持つ 100 人の被験者 (コントロール)。 すべての患者で、卵巣腫瘤に対する外科的介入の前にUtLが収集されます。 洗浄は、閉経前の月経周期の黄体期に行われます。 外科標本は病理学的に評価され、患者は組織学的結果に応じて HGSC 陽性または対照としてカウントされます。 がん患者の場合、TP53、BRCA1、BRCA2 を含む遺伝子のパネルについて、ウィーン医科大学が従来の方法で原発腫瘍の配列を決定します。 匿名化されたすべての患者サンプルについて、収集された臨床情報には、年齢、喫煙歴、以前の化学療法への曝露、出産歴、閉経年齢、初潮年齢、経口避妊薬の使用歴、がんの家族歴、および原発腫瘍の遺伝子変異の状態。 ケースとコントロールは年齢が一致し、感度と特異度に対する年齢の影響を評価するために、できるだけ広い年齢範囲が含まれます。

統計分析: 各サンプルの詳細な変異プロファイルは、デュプレックス シーケンス出力ファイルから生成されます。これには、すべての変異位置の変異対立遺伝子頻度 (MAF)、変異スペクトル、タンパク質機能に対する予測病原性、既知のホットスポットとの関係、および全体的な変異負荷が含まれます。 (配列決定されたヌクレオチドの総数で割った変異ヌクレオチドの数)。 これに続いて、サンプルは症例対照ステータスのために盲検化されます。 UtLs によって収集された DNA からの TP53 MAF は、ロジスティック回帰モデリングによって HGSC を使用する場合と使用しない場合の平均リスク患者 (AIM I) を区別するための予測因子として使用されます。 年齢、喫煙歴、以前の化学療法への曝露、出産歴、閉経年齢、初経年齢、経口避妊薬の使用歴、がんの家族歴、および生殖細胞変異の状態は、潜在的な交絡因子と見なされます。 モデル予測は、交差検証によって評価されます。 類似の分析は、STIC の有無が転帰変数を定義する高リスク患者 (AIM II) のグループに適用されます。 突然変異対立遺伝子頻度のカットオフ値は、両方のケースで提案され、特異性と感度は、適切な信頼区間を含めて推定されます。

目的 1B: バックグラウンド変異負荷によるパーソナライズされたキャリブレーションによる診断性能の向上。

DS の前例のない感度により、癌のような突然変異が複数のヒト組織に年齢とともに非常に低いレベルで蓄積するという新しい発見に私たちは導かれました。 パイロット研究で、スポンサーは、閉経前に広範囲に複製する子宮内膜組織からの DNA 寄与の可能性があるため、平均 BB 変異負荷が他の組織よりも UtL でやや高いことを発見しました。 これはパイロット研究の特異性を損なうものではありませんでしたが、スポンサーは、BB が MAF シグナルが低い非常に初期の腫瘍やバックグラウンドが高い非常に年配の女性に障害をもたらす可能性があることを認識しています. スポンサーは、閉経前の女性の洗浄ろ過と黄体期採取が BB シグナルを減少させると予想していますが、追加の手段として、スポンサーは、個人のバックグラウンド変異負荷を正規化することでパフォーマンスをさらに改善できるかどうかを検討します. スポンサーは、循環白血球における TP53 変異のレベルが、BB を増加させる既知の要因 (年齢など) だけでなく、未知の変異原性曝露または個人の生涯に発生するその他の要因も捕捉する、経験的に測定された個人のキャリブレーターとして役立つ可能性があるという仮説を立てています。 白血球由来の DNA は、おそらく UtL の BB 変異の合計プールに最小限の量しか寄与していませんが、スポンサーは、体の他の場所の BB 変異を比例的に代表することわざの「炭鉱のカナリア」として機能する可能性があると仮定しています。 腫瘍による変異が不明な場合、洗浄液中の BB 変異負荷自体を現実世界の設定で直接測定することはできません。 この概念の妥当性は、腹水における TP53 変異の最初の研究によって示されました。これには、一致する血液サンプルのサブセットが含まれ、BB と年齢との強い関連性が示されました。

方法: 末梢血単核細胞 (PBMC) 成分からの DNA - 手術の直前に収集 - 100 人の HGSC 症例から無作為に選択された 50 人、および Aim 1A の 100 人の対照から 50 人が抽出され、約 10,000x 分子で TP53 DS に供されます。深さ。 PBMC からの TP53 変異は、UtL で見つかった TP53 変異から差し引かれます。

統計分析: スポンサーは、UtL と白血球の TP53 変異頻度との関連を調べ、Aim 1A の偽陰性が白血球の BB 増加の症例に対応するかどうかを判断します。 さらに、スポンサーは白血球の TP53 突然変異頻度を症例管理状態の予測因子として分析し、ここでも 10% 除外手順を使用します。 この革新的なキャリブレーション方法は、固定変異率を使用した単変量モデル、および年齢などの他の患者特性に基づいて開発された調整済み多変量モデルで達成された単純な ROC メトリックと比較されます。 現在の目的とは無関係の科学的疑問として、スポンサーは、白血球 TP53 変異量が患者の年齢、全体的な健康状態、または変異原性曝露の履歴の独立した予測因子として役立つかどうかを知りたがっています.

目指せ1C。 子宮洗浄液とパパニコロウ塗抹標本採取 DNA の診断性能の比較。

経膣リキッドバイオプシーからの卵巣がん検出に NGS を使用した最初の報告は、シーケンシング技術としてパップスメア コレクションと SafeSeqS に依存していました。 引用された 41% の感度は、原理の重要な証拠を提供しましたが、改善の余地も十分にありました。 スポンサーは、SafeSeqS のような方法よりも DS の方が精度が優れていることを明確に実証しており、私たちの研究室で進行中の研究では、UtL と比較してパップスメアの感度が限られていることが示されています。 ただし、同じ患者に対する 2 つの収集方法の直接比較はまだ実行されていません。 パップスメアに対する UtL の優位性を正式に実証することは、商業市場への参入に役立ちます (スポンサーは、関連する NCI SBIR が、上記の研究の著者によって設立された会社である PapGene Inc に与えられたことに注目しています)。 UtL の優位性は、洗浄液が卵管と卵巣の表面に到達するという事実に基づいて予想されますが、パパニコロウ塗抹標本は子宮頸管に到達する播種性癌細胞に依存しています。 それにもかかわらず、パップスメアの TP53 DS が UtL を大幅に下回らない場合、スポンサーはこの補完的な収集方法をさらに調査します。 パパニコロウ塗抹標本は一次医療提供者によって日常的に実施されているため、これらを使用できることは、市場での採用を加速するのに役立つ可能性があります。 しかし、現在のエビデンスは、パップスミアが劣っていると思われることを示しています。

方法: スポンサーは、上記のように TP53 DS を実行しますが、無作為に選択された 25 人のがん症例と Aim 1A からの 25 人の対照の年齢が一致したサブセットの手術前に収集されたパップスメアからの DNA を使用します。

統計分析: 平均リスク患者のサブサンプルから従来のパパニコロウ試験によって収集された DNA からの TP53 MAF に関するデータは、目的 1A および 1B 内で開発されたモデルの追加の予測因子と見なされます。パップスメアと UtLs からの情報を組み合わせることによって得ることができます。

目的 2. 高リスク集団の卵巣がんスクリーニング この目的は、目的 1 と同様のアプローチをとりますが、遺伝性乳がんおよび卵巣がん (HBOC) 変異による卵巣がんのリスクが高い女性に焦点を当てます。 HBOC女性は、乳がんまたは卵巣がんの強力な家族歴によって特定され、がん感受性遺伝子（通常はBRCA1およびBRCA2）に変異があり、生涯HGSCリスクが35%、46%、13%、23%であることが判明しています。それぞれ。 標準的なケアは、リスクを軽減する卵管卵巣摘出術 (RRSO) を早期に行うことであり、通常は出産が完了した後です。 このアプローチは死亡率を低下させますが、完全ではありません。この集団の卵巣がんの約 10% が 40 歳未満で発症します。 ウィーンの症例シリーズでは、癌は 20 歳という若さで見られ、これは通常予防手術が行われるよりもずっと前のことです。 したがって、標準的なケアを行っても、生殖年齢の HBOC 女性は、他の女性と比較して卵巣がんのリスクが大幅に高くなり、効果的なスクリーニングツールの必要性はさらに高くなります。 現在、罹患した女性は、致死率の高い癌のリスクの増加を受け入れるか、出産を忘れる（または早期に終了する）ことを選択するかの決定を下さなければなりません. これは、米国だけで数十万人の女性が直面する、耐え難いほど挑戦的な決定です。 特定の民族グループ、特にアシュケナージ系ユダヤ人では、保因者になるリスクは 40 人に 1 人とも高くなります。 しかし、大部分の BRCA キャリアは、たとえ手術を受けていなくても、HGSC を発症することはありません。 命を救い、生殖能力の選択肢を維持するために、HGCS のリスクが高い女性の早期発見診断ツールが緊急に必要とされています。 この目的の成果物は、そのようなアッセイの商業的に堅牢な性能を実証する 115 人の患者のバイオマーカー データ セットになります。

2Aを目指します。 高リスク患者における HGSC 検出のための UtL での TP53 DS の試験性能を評価すること。

スポンサーは、目的1Aの一般的な方法に従ってこの研究に取り組みます。 重要な違いの 1 つは、UtL が既知の卵巣腫瘤を持つ女性からではなく、RRSO を受けている HBOC 女性から収集されることです。 RRSO の後、卵巣と卵管は、SEE-FIM として知られる細心の注意を払ったセクショニング プロトコルを受け、STIC や潜在的な癌について、組織、特に線毛を注意深く調べます。 この高リスク集団の中で、そのような病変は切除の約 5% に見られます。 がんグループには、SEE-FIM 中に STIC または潜在性腫瘍が見つかった女性が含まれます。コントロール グループには、病変のない女性が含まれます。 この研究デザインは革新的であり、リスクの高い女性だけでなく、特に外科的に治癒可能な非常に初期の癌、場合によっては微視的癌を検出する当社のアッセイの能力に焦点を当てています。

方法: 遺伝性高リスク卵巣がん症候群の最大 115 人の女性からの UtL サンプルを DS で分析します。15 人は STIC または潜在がん (症例) で、最大 100 人はがんなし (対照) です。 ケースとコントロールは年齢によって一致します。 UtL は RRSO の直前に実行されます。 外科標本は、中央で標準化された SEE-FIM プロトコルによって病理学的に評価されます。 RRSO の後、卵巣と卵管は、SEE-FIM として知られる細心の注意を払ったセクショニング プロトコルを受け、STIC や潜在的な癌について、組織、特に線毛を注意深く調べます。 スポンサーは、このコホートで5～15人の女性がSTICまたは潜伏がんを特定していると予想しており、年齢が一致した100人の女性には病変が検出されません。 コントロールよりもがん症例の数が少ないのは、病変陽性手術の割合が低いことと、スポンサー プロジェクトが現実的に達成できるサンプル数を反映しています。 より大きな数が最適ですが、そのようなサンプルは非常に限られています。 がんグループには、SEE-FIM 中に STIC または潜在的な HGSC が見つかった女性が含まれます。コントロール グループには、病変のない女性が含まれます。統計分析: これは、目的 1A のとおりです。

目指せ2B。 バックグラウンド変異負荷によるハイリスク女性の診断閾値キャリブレーション。

この副次的な目的は、目的 1B と同じプロトコルと統計手法を使用し、それらを目的 2 の高リスク集団に適用します。

方法: 利用可能なすべてのがん症例からの白血球 DNA と、対照群のランダムに選択された 30 人の女性サブセットが評価されます。 HBOC女性の悪性腫瘍のリスクは、発癌性変異が生じる可能性を高めるDNA修復の欠陥により、他の女性よりも高くなることは十分に確立されています。 そのため、治験依頼者は、UtL および末梢血で測定された非がん由来のバックグラウンド変異負荷も比例して上昇する可能性があると予想しています。 血液で測定された高いバックグラウンド変異負荷を調整することは、このグループの特異性を高めるために特に重要かもしれません。

統計分析: これは目的 1B のとおりです。

AIM III UtL で HGSC 検出用のメチル化シグネチャを定義する。 過去 15 年間、特に癌診断において、エピジェネティックな腫瘍特異的変化の検出のための DNA メチル化分析の価値が実証されてきました。 卵巣癌 (OC) における DNA メチル化の研究は、OC 細胞によって血流に放出される DNA 断片 (すなわち、 cell-free DNA - cfDNA) は、cfDNA の DNA メチル化パターンが、診断の最大 2 年前に OC の割合を検出する可能性があることを示唆しています。 この研究はまた、このアプローチの限界を明確に示しています。なぜなら、最終的に高悪性度漿液性卵巣がん (HGSC) を 2 年以内に発症した全患者の 50% しか検出できなかったからです。 根底にある問題は、血流中の cfDNA の濃度が低いため、非常に弱いシグナルを検出する必要があることです。 HGSC 検出の感度を潜在的に高める目的で、スポンサーは、オーストリア工科大学 (AIT) のコンピテンス ユニット分子診断部門の Andreas Weinhäusel 教授と協力して、以下に含まれる患者のサブセットで概念実証研究を実施します。このプロジェクト。 Andreas Weinhäusel 教授は、HGSC に関連する 96 のメチル化マーカーを特定しました。 DNA メチル化に必要な DNA はごく少量です。 したがって、テスト手順の特異性と感度のさらなる開発のために、この研究の過程で抽出された、洗浄液と対応する腫瘍組織から既に利用可能な DNA を使用することをお勧めします。 AIM3 の製品は、このようなアッセイの高感度性能を実証する 140 の患者メチル化マーカー データ セットになります。

方法: 30 人の HGSC 患者および 10 人の STIC/潜在癌からの UtL および対応する腫瘍組織からのゲノム DNA は、メチル化感受性制限酵素の助けを借りてメチル化 DNA が濃縮されます。 この DNA は、5 x 96 マーカー x 96 DNA が並行して分析されるハイスループット put-qPCR を実行することによって分析されます。 最も有益なマーカーは、メチル化シグネチャに結合されます。 60 のコントロールからの UtL からの署名 DNA の特異性を証明するために分析されます (30 の平均リスクと 30 の高リスクのケース)。 DNA メチル化パターンの評価は、切除前の洗浄液および最大 10 個の STIC 病変/潜在がんに対して実施されます。 局所病理学の結果がSTICまたは潜伏がん細胞（FFPE組織）を特定すると、レーザーマイクロダイセクションとDNA分離が行われます。 続いて、AIM 1 および AIM 2 で説明されているように、標準 NGS TP53 シーケンシングを適用します。このパイロット サブスタディでは、ハイスループット put-qPCR を残りの DNA 材料に適用して、メチル化状態を評価します。

統計分析: 単純な PCR テスト用の DNA メチル化シグネチャを定義する可能性を評価することを目的として、96 プレックスのハイスループット MSREqPCR 分析からの dCT-PCR 値をバイオインフォマティクスおよび生物統計学によって分析し、1) 関連する臨床試験間のクラス比較を行います。有意に異なるメチル化遺伝子を定義するためのサブタイプとクラス。 2) 単一マーカー p 値に基づくさまざまな特徴選択アプローチを使用した多変量クラス予測分析。 さまざまな分類アルゴリズム (例: k 最近傍、サポート ベクター マシン、線形識別分析など) が適用され、最適な候補メチル化マーカーを選択するための 10 倍交差検証および/または leave-one-out 交差検証とアルゴリズムが使用されます。さらに、単一の候補メチル化マーカーの上位 AUC 値が ROC 分析で定義され、マーカー選択のために考慮されます。

48 の候補マーカーのサブセットが、別のサンプル セットでの確認のために選択されます。 そこから得られたメチル化データは、480plexed分析から得られた最初のデータセットと同様の方法で、クラス比較およびクラス予測分析を使用して分析されます。 多変量解析からの最高性能の単一マーカーおよびマーカーの組み合わせが定義されます。 分類結果およびメチル化データを p53 変異検査結果と比較して、メチル化に基づく診断分類の可能性を、単独で、および p53 変異分析と組み合わせて評価します。 これは、p53 とメチル化データの両方を多変量モデルに統合するさまざまなクラス予測アプローチを適用して実施されます。