Detecção Precoce de Câncer de Ovário de Alto Grau Usando Lavagem Uterina Estudo EHUD e Sequenciamento Duplex (EHUD)

ABORDAGEM FASE I A Universidade de Washington demonstrou a prova diagnóstica de princípio; no entanto, é necessária mais otimização e validação para implantação em escala industrial. Na Fase I, o método de filtração UtL será otimizado (objetivo 1), o desempenho analítico no fluxo de trabalho comercial será validado (objetivo 2) e um marco de coleta de amostras será alcançado (objetivo 3). Objetivo 1. Determinar a utilidade da filtração da lavagem uterina para maximizar o enriquecimento do DNA derivado do tumor. Testes preliminares com duas amostras indicaram que a filtração de UtLs para remover aglomerados de células endometriais poderia aumentar a sensibilidade para mutações tumorais várias vezes. Este conjunto de dados será expandido analisando o efeito de filtração em 10 UtLs de pacientes com HGSC com mutações TP53 conhecidas. Cada UtL será dividido ao meio: a primeira metade será filtrada e a segunda ficará sem filtro. O DNA será extraído das frações filtrada, filtrada e não filtrada e analisado por TP53 DS (total de 30 amostras). Para cada UtL será comparado o rendimento de DNA em cada uma das frações e o MAF da mutação tumoral. Prevê-se que a fração filtrada conterá menos DNA do que a fração não filtrada, mas a mutação do tumor estará presente em uma frequência mais alta. Se a sensibilidade for melhorada (ou seja, mais é ganho pelo enriquecimento do que é perdido pela redução de DNA menos disponível), a filtração será usada em todas as futuras amostras coletadas. Objetivo 2. Validação do ensaio otimizado: exatidão, precisão, limite de detecção e reprodutibilidade. A TwinStrand desenvolveu um fluxo de trabalho DS simplificado usando adaptadores aprimorados, química de ligação e um formato baseado em placa de 96 poços de alto rendimento adequado para robôs de manuseio de líquidos e compatível com os padrões de laboratório CLIA.

A TwinStrand também desenvolveu um pipeline de análise baseado em nuvem otimizado que oferece suporte ao processamento paralelo automatizado de várias amostras. O processo otimizado para a detecção de mutações TP53 em amostras UtL será validado. Para avaliar a precisão, precisão técnica e limite inferior de detecção, amostras de DNA de dois indivíduos que diferem em genótipo em > 5 locais SNP em ou próximo a TP53 serão misturadas, em proporções de 1:100 1:5.000, dois UtL. As misturas serão sequenciadas a ~10.000x de profundidade molecular em dois experimentos independentes. A fração de alelos SNP (AF) será comparada em diferentes diluições para determinar a exatidão (AF esperada vs. AF observada), precisão (variação de AF entre réplicas) e o menor limite de detecção alcançável. Para testar a reprodutibilidade do ensaio em seu uso clínico pretendido, o sequenciamento será repetido nas 30 amostras usadas no Objetivo 1, que abrangerá uma ampla gama de MAFs tumorais. O Patrocinador calculará o coeficiente de variação entre réplicas. Com base em estudos piloto, o Patrocinador prevê excelente reprodutibilidade (CV<5%). Objetivo 3. Coleta de amostras. A coleta das amostras propostas na Fase II será iniciada sob aprovação apropriada do CEP/Comitê de Ética de cada instituição participante.

Após a coleta, as amostras são enviadas ao Instituto de Pesquisa do Câncer da Universidade Médica de Viena, que realizará a filtração UtL e a extração de DNA.

DNA pareado de exames de Papanicolaou e leucócitos periféricos também serão extraídos. Os DNAs isolados receberão um número de identificação e serão enviados para TwinStrand para Duplex Sequencing.

Marcos da Fase I:

1. Confirme a utilidade da filtração UtL no enriquecimento da mutação tumoral.
2. Quantifique a exatidão, a precisão, o limite inferior de detecção e a reprodutibilidade do ensaio simplificado em UtLs.
3. Inicie a coleta de amostras para a Fase II.

Produtos da Fase I:

1. Fluxo de trabalho DS pronto para aplicação ao DNA UtL em escala comercial na Fase II e Fase III.
2. Banco de amostras para a Fase II

ABORDAGEM FASE II A Fase II validará o uso de TP53 DS em UtLs para detecção precoce de câncer de ovário em coortes expandidas de pacientes de caso-controle abrangendo populações de risco médio e alto. Parâmetros predefinidos que podem afetar a sensibilidade e especificidade da frequência de mutação TP53 serão examinados e modelados estatisticamente. A sensibilidade e a especificidade clínicas serão maximizadas pela construção de modelos estatísticos de limiar de diagnóstico personalizados usando características clínicas multivariadas, bem como a carga de mutação de fundo única de cada indivíduo com base no sequenciamento de leucócitos. Em um subconjunto de pacientes, o desempenho superior da UtL sobre a amostragem de Papanicolaou será confirmado. Além disso, um estudo de prova de conceito será conduzido em um subconjunto de pacientes incluídos para estudar um conjunto de 96 marcadores de metilação relevantes para HGSC em UtLs e tecido tumoral/STICs correspondentes.

OBJETIVO 1. TRIAGEM DE CÂNCER DE OVÁRIO NA POPULAÇÃO GERAL Este objetivo desenvolverá um biomarcador para detecção de HGSC em uma população de risco médio. O Patrocinador conduzirá um estudo de controle de caso que integra dados mutacionais TP53 DS com informações patológicas clínicas para identificar mulheres com HGSC com sensibilidade e especificidade máximas. Mais de 98% das HGSCs carregam mutações no TP53, o que significa que o DS ultraprofundo pode ser focado de maneira econômica em apenas uma pequena região genômica. O produto desse objetivo será um conjunto de dados de biomarcadores de 200 pacientes que demonstre o desempenho econômico e comercialmente robusto desse diagnóstico de câncer de ovário extremamente necessário.

Objetivo 1A: Avaliar o desempenho do teste de TP53 DS em UtLs para detecção de HGSC em pacientes de risco médio.

Métodos: Amostras UtL de 200 indivíduos da população de risco médio serão analisadas via DS: 100 indivíduos com HGSC (casos) e 100 indivíduos com lesões que foram consideradas benignas após a ressecção, ou seja, sem câncer (controles). Em todas as pacientes, UtL será coletado antes da intervenção cirúrgica para uma massa ovariana. A lavagem será realizada durante a fase lútea do ciclo menstrual se estiver na pré-menopausa. Os espécimes cirúrgicos serão avaliados patologicamente e um paciente será considerado um HGSC positivo ou um controle, dependendo dos resultados histológicos. Para pacientes com câncer, o tumor primário será sequenciado por métodos convencionais pela Universidade Médica de Viena para um painel de genes que inclui TP53, BRCA1 e BRCA2. Para todas as amostras de pacientes não identificadas, as informações clínicas coletadas incluirão: idade, história de tabagismo, exposição prévia à quimioterapia, paridade, idade da menopausa, idade da menarca, história de uso de contraceptivos orais, história familiar de câncer e sete estado de mutação genética do tumor primário. Casos e controles serão pareados por idade e uma faixa etária tão ampla quanto possível será incluída para avaliar o efeito da idade na sensibilidade e especificidade.

Análise estatística: Um perfil de mutação detalhado para cada amostra será gerado a partir dos arquivos de saída do sequenciamento duplex, incluindo: frequência de alelos mutantes (MAF) para todas as posições mutantes, espectro de mutação, patogenicidade prevista para a função da proteína, relação com hotspots conhecidos e carga de mutação geral (número de nucleotídeos mutantes dividido pelo número total de nucleotídeos sequenciados). Depois disso, as amostras serão reveladas para o status de casos-controles. TP53 MAF de DNA coletado por UtLs será usado como preditor para diferenciar entre pacientes de risco médio (AIM I) com e sem HGSC por modelagem de regressão logística. Idade, história de tabagismo, exposição prévia à quimioterapia, paridade, idade da menopausa, idade da menarca, história de uso de contraceptivos orais, história familiar de câncer e estado de mutação germinativa serão considerados como possíveis fatores de confusão. A previsão do modelo será avaliada por validação cruzada. Uma análise análoga será aplicada ao grupo de pacientes de alto risco (AIM II) onde a presença e ausência de STIC é a variável de desfecho definidora. Valores de corte para frequência de alelos mutantes serão sugeridos em ambos os casos e especificidade e sensibilidade serão estimadas incluindo intervalos de confiança apropriados.

Objetivo 1B: Melhorar o desempenho do diagnóstico com calibração personalizada por carga de mutação de fundo.

A sensibilidade sem precedentes do DS nos levou à nova descoberta de que mutações semelhantes ao câncer se acumulam em níveis muito baixos com a idade em vários tecidos humanos. Em um estudo piloto, o patrocinador descobriu que a carga média de mutação BB é um pouco maior em UtLs do que em outros tecidos, possivelmente devido à contribuição do DNA do tecido endometrial, que se replica extensivamente antes da menopausa. Embora isso não tenha comprometido a especificidade do estudo piloto, o patrocinador reconhece que o BB pode representar um obstáculo em alguns tumores muito precoces, nos quais o sinal do MAF é baixo, ou em mulheres muito idosas, nos quais o histórico é alto. O patrocinador espera que a filtração da lavagem e a coleta da fase lútea em mulheres na pré-menopausa reduzam o sinal BB, mas como uma medida adicional, o patrocinador examinará se o desempenho pode ser melhorado pela normalização da carga de mutação de fundo de um indivíduo. O patrocinador levanta a hipótese de que o nível de mutações TP53 em leucócitos circulantes pode servir como um calibrador pessoal medido empiricamente que captura não apenas fatores conhecidos que aumentam o BB, como idade, mas também exposições mutagênicas desconhecidas ou outros fatores que ocorrem durante a vida de uma pessoa. Embora o DNA dos leucócitos provavelmente contribua apenas com uma quantidade mínima para o pool total de mutações BB em UtLs, o patrocinador postula que eles podem servir como um proverbial "canário em uma mina de carvão" que será proporcionalmente representativo de mutações BB em outras partes do corpo. A carga de mutação BB em uma lavagem, em si, não pode ser medida diretamente em um cenário do mundo real quando a(s) mutação(ões) contribuída(s) por um tumor é(são) desconhecida(s). A plausibilidade desse conceito foi demonstrada por nosso estudo inicial das mutações TP53 no líquido peritoneal, que incluiu um subconjunto de amostras de sangue correspondentes e indicou uma forte associação entre BB e idade.

Métodos: O DNA do componente de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) - coletado imediatamente antes de uma cirurgia - de 50 escolhidos aleatoriamente de 100 casos de HGSC e 50 de 100 controles de Aim 1A será extraído e submetido a TP53 DS em ~ 10.000x molecular profundidade. As mutações TP53 de PBMCs serão subtraídas das mutações TP53 encontradas no UtL.

Análise Estatística: O Patrocinador examinará a associação entre as frequências de mutação TP53 em UtL e leucócitos e determinará se falsos negativos no Objetivo 1A correspondem a casos com aumento de BB em leucócitos. Além disso, o patrocinador analisará as frequências de mutação TP53 em leucócitos como um preditor do status de controle de caso, novamente usando o procedimento de exclusão de 10%. Este método de calibração inovador será comparado com as métricas ROC simples obtidas com o modelo univariado usando uma fração de mutação fixa, bem como o modelo multivariado ajustado desenvolvido com base em outras características do paciente, como a idade. Como uma questão científica não relacionada aos presentes objetivos, o patrocinador está ansioso para ver se a carga de mutação leucocitária TP53 servirá como um preditor independente da idade do paciente, saúde geral ou histórico de exposições mutagênicas.

Objetivo 1C. Comparação do desempenho diagnóstico de lavagem uterina versus DNA coletado por exame de Papanicolaou.

O primeiro relato do uso de NGS para detecção de câncer de ovário a partir de uma biópsia líquida transvaginal contou com a coleta de esfregaço de Papanicolaou e SafeSeqS como tecnologia de sequenciamento. A sensibilidade citada de 41% forneceu uma importante prova de princípio, mas também um amplo espaço para melhorias. O patrocinador demonstrou definitivamente a precisão superior do DS em relação aos métodos do tipo SafeSeqS e estudos em andamento em nosso laboratório indicam sensibilidade limitada de exames de Papanicolaou em comparação com UtL. No entanto, uma comparação direta dos dois métodos de coleta nos mesmos pacientes ainda precisa ser realizada. Demonstrar formalmente o grau de superioridade do UtL sobre os exames de Papanicolau ajudará na entrada no mercado comercial (o patrocinador observa que um NCI SBIR relacionado foi concedido à PapGene Inc, uma empresa fundada pelos autores do estudo mencionado acima). A superioridade do UtL é esperada com base no fato de que as lavagens atingem as trompas de falópio e as superfícies ovarianas, enquanto os exames de Papanicolau dependem de células cancerígenas disseminadas que atingem o canal cervical. No entanto, no caso de TP53 DS em exames de Papanicolaou não ter desempenho inferior ao UtL, o patrocinador exploraria ainda mais esse método de coleta complementar. Como os exames de Papanicolau são realizados rotineiramente por prestadores de cuidados primários, a capacidade de usá-los pode ajudar a acelerar a adoção no mercado. No entanto, as evidências atuais apontam para a provável inferioridade do exame de Papanicolaou.

Métodos: O patrocinador realizará TP53 DS como acima, mas usando DNA de exames de Papanicolaou coletados antes da cirurgia de subconjunto de 25 casos de câncer e 25 controles selecionados aleatoriamente, pareados por idade, do Objetivo 1A.

Análise Estatística: Dados sobre TP53 MAF de DNA coletados por exames de Papanicolaou convencionais de uma subamostra de pacientes de risco médio serão considerados como preditores adicionais em modelos desenvolvidos dentro do objetivo 1A e 1B. O patrocinador investigará se há algum poder adicional para discriminar casos de controles pode ser obtido combinando informações de exames de Papanicolaou e UtLs.

OBJETIVO 2. RASTREIO DE CÂNCER DE OVÁRIO NA POPULAÇÃO DE ALTO RISCO Este objetivo terá uma abordagem semelhante à do Objetivo 1, mas se concentrará em mulheres com alto risco de câncer de ovário devido a mutações hereditárias do câncer de mama e ovário (HBOC). As mulheres com HBOC terão sido identificadas por um forte histórico familiar de câncer de mama ou ovário e portadoras de mutações nos genes de suscetibilidade ao câncer, geralmente BRCA1 e BRCA2, que conferem um risco vitalício de HGSC de 35%, 46% e 13%, 23%, respectivamente. O padrão de tratamento é a salpingo-ooforectomia com redução de risco (RRSO) em uma idade precoce, geralmente após a conclusão do parto. Embora essa abordagem diminua a mortalidade, ela é imperfeita: aproximadamente 10% dos cânceres de ovário nessa população se desenvolvem antes dos 40 anos. Na série de casos de Viena, os cânceres foram vistos em uma idade tão jovem quanto 20 anos, o que é bem antes de uma cirurgia profilática normalmente ter sido realizada. Assim, mesmo com o padrão de atendimento, as mulheres HBOC em seus anos reprodutivos têm um risco significativamente elevado de câncer de ovário em relação a outras mulheres, sua necessidade de uma ferramenta de triagem eficaz é ainda maior. Atualmente, as mulheres afetadas devem tomar a decisão de aceitar o risco aumentado de um câncer altamente letal ou optar por esquecer (ou interromper prematuramente) a gravidez. Esta é uma decisão terrivelmente desafiadora enfrentada por centenas de milhares de mulheres somente nos Estados Unidos. Em certos grupos étnicos, particularmente os judeus Ashkenazi, o risco de ser portador é de 1 em 40. No entanto, a maioria dos portadores de BRCA, mesmo aqueles que não fazem cirurgia, nunca desenvolverá HGSC. Há uma necessidade urgente de ferramentas de diagnóstico de detecção precoce em mulheres com alto risco de HGCS, a fim de salvar vidas e preservar a escolha da fertilidade. O produto deste objetivo será um conjunto de dados de biomarcadores de 115 pacientes que demonstre o desempenho comercialmente robusto de tal ensaio.

Objetivo 2A. Avaliar o desempenho do teste de TP53 DS em UtLs para detecção de HGSC em pacientes de alto risco.

O patrocinador abordará este estudo de acordo com os métodos gerais do Objetivo 1A. Uma diferença significativa é que UtL será coletado de mulheres com HBOC submetidas a RRSO, e não de mulheres com massas ovarianas conhecidas. Após a RRSO, os ovários e as trompas de falópio passam por um meticuloso protocolo de seccionamento conhecido como SEE-FIM para examinar cuidadosamente os tecidos, principalmente as fímbrias, em busca de STICs e cânceres ocultos. Nessa população de alto risco, essas lesões são encontradas em cerca de 5% das ressecções. O grupo de câncer abrangerá mulheres onde STICs ou tumores ocultos foram encontrados durante o SEE-FIM, o grupo de controle incluirá mulheres sem lesões. Este desenho de estudo é inovador na medida em que se concentra, não apenas em mulheres de alto risco, mas especificamente na capacidade do nosso ensaio para detectar cânceres em estágio muito inicial, potencialmente até mesmo microscópicos, quando eles permanecem curáveis ​​cirurgicamente.

Métodos: Amostras UtL de até 115 mulheres com síndromes hereditárias de câncer de ovário de alto risco serão analisadas via DS: 15 com STICs ou câncer oculto (casos) e até 100 livres de câncer (controles). Caso e controle serão pareados por idade. UtLs serão realizados imediatamente antes do RRSO. Os espécimes cirúrgicos serão avaliados patologicamente por um protocolo SEE-FIM padronizado centralmente. Após a RRSO, os ovários e as trompas de falópio passam por um meticuloso protocolo de seccionamento conhecido como SEE-FIM para examinar cuidadosamente os tecidos, principalmente as fímbrias, em busca de STICs e cânceres ocultos. O patrocinador espera ter identificado de 5 a 15 mulheres com STIC ou câncer oculto nesta coorte, 100 mulheres da mesma idade não terão lesões detectadas. O menor número de casos de câncer do que os controles reflete o baixo percentual de cirurgias positivas para lesões e o número de amostras que o projeto patrocinador pode realisticamente alcançar. Embora um número maior fosse ideal, tais amostras são extremamente limitadas. O grupo de câncer abrangerá mulheres onde STICs ou HGSC ocultos foram encontrados durante o SEE-FIM, o grupo de controle incluirá mulheres sem lesões. Análise estatística: Será de acordo com o Objetivo 1A.

Objetivo 2B. Calibração do limiar diagnóstico em mulheres de alto risco por carga de mutação de fundo.

Este subobjetivo usará o mesmo protocolo e métodos estatísticos do objetivo 1B e os aplicará à população de alto risco do objetivo 2.

Métodos: O DNA leucocitário de todos os casos de câncer disponíveis e um subconjunto de 30 mulheres escolhido aleatoriamente do grupo controle serão avaliados. Está bem estabelecido que o risco de malignidade em mulheres com HBOC é elevado em relação a outras em virtude de defeitos no reparo do DNA que aumentam a probabilidade de surgimento de mutações oncogênicas. Como tal, o patrocinador antecipa que a carga de mutação de fundo não derivada de câncer medida em UtLs, bem como no sangue periférico, também pode ser proporcionalmente elevada. O ajuste para a alta carga de mutação de fundo medida no sangue pode ser particularmente importante para aumentar a especificidade neste grupo.

Análise estatística: Será de acordo com o Objetivo 1B.

AIM III Definir uma assinatura de metilação para detecção de HGSC em UtLs. Nos últimos 15 anos, o valor da análise de metilação do DNA para a detecção de alterações epigenéticas específicas do tumor foi demonstrado, particularmente no diagnóstico de câncer. Estudos de metilação do DNA no câncer de ovário (CO) focaram na detecção de fragmentos de DNA liberados por células OC na corrente sanguínea (i.e. DNA livre de células - cfDNA) sugerem que os padrões de metilação do DNA no cfDNA têm o potencial de detectar uma proporção de OCs até dois anos antes do diagnóstico. Este estudo também mostra claramente a limitação desta abordagem porque apenas 50% de todos os pacientes que finalmente desenvolveram câncer de ovário seroso de alto grau (HGSC) dentro de dois anos puderam ser detectados. O problema subjacente é que, devido à baixa concentração de cfDNA na corrente sanguínea, um sinal muito fraco precisa ser detectado. Com o objetivo de aumentar potencialmente a sensibilidade da detecção de HGSC, o patrocinador, em cooperação com o Prof. Andreas Weinhäusel, Instituto Austríaco de Tecnologia (AIT), Unidade de Competência em Diagnóstico Molecular, realizará um estudo de prova de conceito em um subconjunto de pacientes incluídos no este projeto. Prof. Andreas Weinhäusel, identificou 96 marcadores de metilação relevantes para HGSC. Apenas uma quantidade muito pequena de DNA é necessária para a metilação do DNA. Portanto, é aconselhável usar o DNA já disponível das lavagens e o tecido tumoral correspondente, que foi extraído no decorrer deste estudo, para o desenvolvimento da especificidade e sensibilidade do procedimento de teste. O produto do AIM3 será um conjunto de dados de marcadores de metilação de 140 pacientes que demonstra o desempenho de alta sensibilidade de tal ensaio.

Métodos: DNA genômico de UtLs e tecido tumoral correspondente de 30 pacientes HGSC e 10 STICs/cânceres ocultos serão enriquecidos para DNA metilado com o auxílio de enzimas de restrição sensíveis à metilação. Este DNA será analisado através da realização de um highthrough put-qPCR no qual 5 x 96 marcador x 96 DNA serão analisados ​​em paralelo. Os marcadores mais informativos serão combinados a uma assinatura de metilação. Para comprovar a especificidade da assinatura de DNA de UtLs de 60 controles serão analisados ​​(30 casos de risco médio e 30 casos de alto risco). A avaliação do padrão de metilação do DNA será realizada nas lavagens pré-ressecção e em até 10 lesões STIC/cânceres ocultos. Quando os resultados da patologia local identificarem STICs ou células cancerígenas ocultas (tecido FFPE), a microdissecção a laser e o isolamento do DNA serão realizados. A aplicação subsequente do sequenciamento NGS TP53 padrão será realizada conforme descrito no AIM 1 e AIM 2. Neste subestudo piloto, o qPCR de alto rendimento será aplicado ao material de DNA restante para avaliação do estado de metilação.

Análise estatística: com o objetivo de avaliar o potencial para definir uma assinatura de metilação de DNA para testes de PCR simples, os valores de dCT-PCR da análise MSREqPCR de alto rendimento de 96 plexos serão analisados ​​por bioinformática e bioestatística para realizar 1) comparação de classe entre os dados clínicos relevantes subtipos e classes para definir genes significativamente metilados diferencialmente; 2) análise multivariada de predição de classe usando diferentes abordagens de seleção de características baseadas em valores-p de um único marcador. Diferentes algoritmos de classificação (por exemplo, k-vizinho mais próximo, máquinas de vetores de suporte, análises de discriminação linear, etc.) serão aplicadas, usando validação cruzada de 10 vezes e/ou validação cruzada deixe uma de fora para selecionar os melhores marcadores de metilação candidatos - e algoritmos; além disso, os valores máximos de AUC de marcadores de metilação de candidato único serão definidos na análise ROC e considerados para a seleção do marcador.

Um subconjunto de 48 marcadores candidatos será selecionado para confirmação em um conjunto de amostras separado. Os dados de metilação deles derivados serão analisados ​​usando comparação de classe e análise de predição de classe de maneira semelhante ao primeiro conjunto de dados derivados da análise 480plexada. Marcadores únicos de melhor desempenho e combinações de marcadores de análise multivariada serão definidos. Os resultados da classificação e os dados de metilação serão comparados com os resultados do teste de mutação p53 para avaliar o potencial de classificação diagnóstica baseada em metilação, isoladamente e em combinação com a análise de mutação p53. Isso será conduzido aplicando diferentes abordagens de predição de classe integrando p53 e dados de metilação em modelos multivariados.