자궁세척 EHUD 연구 및 듀플렉스 시퀀싱을 사용한 고급 난소암의 조기 발견 (EHUD)

접근 1단계 워싱턴 대학은 진단 원리 증명을 시연했습니다. 그러나 산업 규모의 배포에는 추가 최적화 및 검증이 필요합니다. 1단계에서는 UtL 여과 방법이 최적화되고(목표 1) 상업적 작업 흐름에 대한 분석 성능이 검증되고(목표 2) 샘플 수집 이정표가 달성됩니다(목표 3). 목표 1. 종양 유래 DNA의 농축을 최대화하기 위한 자궁 세척 여과의 유용성을 결정합니다. 2개의 샘플을 사용한 예비 테스트는 자궁내막 세포 클러스터를 제거하기 위한 UtL의 여과가 종양 돌연변이에 대한 민감도를 몇 배 증가시킬 수 있음을 나타냅니다. 이 데이터 세트는 알려진 TP53 돌연변이가 있는 HGSC 환자의 10 UtL에서 여과 효과를 분석하여 확장됩니다. 각 UtL은 반으로 나뉩니다. 첫 번째 절반은 필터링되고 두 번째 절반은 필터링되지 않은 상태로 유지됩니다. 여과된 분획, 여과된 분획, 여과되지 않은 분획에서 DNA를 추출하고 TP53 DS로 분석합니다(총 30개 샘플). 각 UtL에 대해 각 분획의 DNA 수율과 종양 돌연변이의 MAF를 비교합니다. 여과된 분획은 여과되지 않은 분획보다 적은 DNA를 포함할 것으로 예상되지만 종양 돌연변이는 더 높은 빈도로 존재할 것입니다. 감도가 개선되면(즉, 사용 가능한 DNA가 적어서 감소하여 손실된 것보다 농축으로 더 많이 얻은 것) 향후 수집된 모든 샘플에 대해 여과가 사용됩니다. 목표 2. 최적화된 분석의 검증: 정확도, 정밀성, 검출 한계 및 재현성. TwinStrand는 개선된 어댑터, 결찰 화학 및 액체 처리 로봇에 적합하고 CLIA 실험실 표준과 호환되는 높은 처리량 96웰 플레이트 기반 형식을 사용하여 간소화된 DS 워크플로우를 개발했습니다.

TwinStrand는 또한 여러 샘플의 자동화된 병렬 처리를 지원하는 최적화된 클라우드 기반 분석 파이프라인을 개발했습니다. UtL 샘플에서 TP53 돌연변이 검출을 위한 최적화된 프로세스가 검증될 것입니다. 정확성, 기술적 정밀도 및 검출 하한을 평가하기 위해 TP53 또는 그 근처에서 >5 SNP 사이트에서 유전자형이 다른 두 개인의 DNA 샘플을 1:100에서 1:5,000, 2 UtL의 비율로 혼합합니다. 혼합물은 두 개의 독립적인 실험에서 ~10,000x 분자 깊이에서 시퀀싱됩니다. SNP 대립유전자 분율(AF)은 정확도(예상 AF 대 관찰된 AF), 정밀도(복제물 간의 AF 변동) 및 달성 가능한 최저 검출 한계를 결정하기 위해 다양한 희석에서 비교됩니다. 의도된 임상 용도에서 분석 재현성을 테스트하기 위해 광범위한 종양 MAF를 포함하는 목표 1에 사용된 30개의 샘플에 대해 시퀀싱을 반복합니다. 후원사는 복제물 간의 변동 계수를 계산합니다. 파일럿 연구를 기반으로 스폰서는 우수한 재현성(CV<5%)을 예상합니다. 목표 3. 샘플 수집. 2단계에서 제안된 샘플 수집은 각 참여 기관에서 적절한 IRB/윤리 위원회 승인에 따라 시작됩니다.

수집 후 샘플은 UtL 여과 및 DNA 추출을 수행할 비엔나 의과 대학의 암 연구 연구소로 배송됩니다.

Pap smears 및 말초 백혈구에서 한 쌍의 DNA도 추출됩니다. 분리된 DNA에는 식별 번호가 할당되고 Duplex Sequencing을 위해 TwinStrand로 배송됩니다.

1단계 이정표:

1. 종양 돌연변이 강화에 대한 UtL 여과의 유용성을 확인합니다.
2. UtL에서 능률화된 분석의 정확도, 정밀도, 검출 하한 및 재현성을 정량화합니다.
3. 2단계를 위한 샘플 수집을 시작합니다.

1상 제품:

1. II상 및 III상에서 상업적 규모로 UtL DNA에 적용할 준비가 된 DS 워크플로.
2. 2상 샘플 뱅크

접근 2단계 2단계에서는 평균 및 고위험 집단을 모두 포함하는 확장된 사례 대조군 환자 코호트에서 조기 난소암 발견을 위해 UtL에서 TP53 DS의 사용을 검증할 것입니다. TP53 돌연변이 빈도의 민감도와 특이성에 영향을 미칠 수 있는 미리 정의된 매개변수를 검사하고 통계적으로 모델링합니다. 백혈구 염기서열 분석을 기반으로 한 개인의 고유한 배경 돌연변이 부하뿐 아니라 다변량 임상 특성을 이용한 개인별 진단 역치 통계 모델을 구축하여 임상적 민감도와 특이도를 극대화할 것입니다. 환자의 하위 집합에서 Pap smear 샘플링보다 UtL의 우수한 성능이 확인될 것입니다. 또한, UtL 및 해당 종양 조직/STIC에서 HGSC와 관련된 96개의 메틸화 마커 세트를 연구하기 위해 포함된 환자의 하위 세트에서 개념 증명 연구를 수행할 것입니다.

목표 1. 일반 인구 난소암 스크리닝 이 목표는 평균 위험 인구에서 HGSC 검출을 위한 바이오마커를 개발할 것입니다. 의뢰자는 최대 민감도와 특이도로 HGSC를 가진 여성을 식별하기 위해 TP53 DS 돌연변이 데이터를 임상 병리학적 정보와 통합하는 사례 통제 연구를 수행할 것입니다. HGSC의 98% 이상이 TP53에 돌연변이를 가지고 있는데, 이는 매우 깊은 DS가 작은 게놈 영역에만 비용 효율적으로 집중될 수 있음을 의미합니다. 이 목표의 산물은 200명의 환자 바이오마커 데이터 세트가 될 것입니다. 이 데이터 세트는 절실히 필요한 이 난소암 진단의 비용 효율적이고 상업적으로 강력한 성능을 보여줍니다.

목표 1A: 평균 위험 환자의 HGSC 검출을 위해 UtL에서 TP53 DS의 테스트 성능을 평가합니다.

방법: 평균 위험 집단의 200명의 피험자로부터의 UtL 샘플은 DS를 통해 분석될 것입니다: HGSC가 있는 100명의 피험자(사례) 및 절제 후 궁극적으로 양성인 것으로 밝혀진 병변이 있는 100명의 피험자, 즉 암이 없는(대조군). 모든 환자에서 UtL은 난소 종괴에 대한 외과적 개입 이전에 수집됩니다. 폐경 전인 경우 월경 주기의 황체기에 세척을 실시합니다. 수술 표본은 병리학적으로 평가되며 환자는 조직학적 결과에 따라 HGSC 양성 또는 대조군으로 계산됩니다. 암 환자의 경우 원발 종양은 TP53, BRCA1 및 BRCA2를 포함하는 유전자 패널에 대해 비엔나 의과 대학에서 기존 방법을 통해 시퀀싱됩니다. 식별되지 않은 모든 환자 샘플에 대해 수집된 임상 정보에는 연령, 흡연 이력, 이전 화학 요법 노출, 출산력, 폐경 연령, 초경 연령, 경구 피임 사용 이력, 암 가족력 및 7- 원발성 종양의 유전자 돌연변이 상태. 사례와 통제군은 연령이 일치하고 민감도와 특이도에 대한 연령의 영향을 평가하기 위해 가능한 한 넓은 연령 범위가 포함됩니다.

통계 분석: 각 샘플에 대한 상세한 돌연변이 프로파일은 다음을 포함하는 듀플렉스 시퀀싱 출력 파일에서 생성됩니다: 모든 돌연변이 위치에 대한 돌연변이 대립유전자 빈도(MAF), 돌연변이 스펙트럼, 단백질 기능에 대한 예측된 병원성, 알려진 핫스팟과의 관계 및 전체 돌연변이 로드 (돌연변이 뉴클레오티드의 수를 시퀀싱된 뉴클레오티드의 총 수로 나눈 값). 그 후 샘플은 사례-대조군 상태에 대해 눈가림이 해제됩니다. UtLs에 의해 수집된 DNA의 TP53 MAF는 로지스틱 회귀 모델링에 의해 HGSC가 있거나 없는 평균 위험 환자(AIM I)를 구별하기 위한 예측인자로 사용될 것입니다. 연령, 흡연 이력, 이전 화학 요법 노출, 출산력, 폐경 연령, 초경 연령, 경구 피임약 사용 이력, 암 가족력 및 생식계열 돌연변이 상태가 잠재적 혼란 요인으로 간주됩니다. 모델 예측은 교차 검증으로 평가됩니다. STIC의 유무가 결과 변수를 정의하는 고위험 환자 그룹(AIM II)에 유사한 분석이 적용될 것입니다. 두 경우 모두에서 돌연변이 대립유전자 빈도에 대한 컷오프 값이 제시되고 적절한 신뢰 구간을 포함하여 특이성과 민감도가 추정됩니다.

목표 1B: 백그라운드 돌연변이 로드에 의한 개인화된 보정으로 진단 성능 향상.

DS의 전례 없는 민감성은 돌연변이와 같은 암이 여러 인간 조직에서 나이가 들면서 매우 낮은 수준으로 축적된다는 새로운 발견으로 우리를 이끌었습니다. 파일럿 연구에서 스폰서는 평균 BB 돌연변이 부하가 다른 조직보다 UtL에서 다소 높다는 것을 발견했는데, 이는 잠재적으로 폐경기 이전에 광범위하게 복제되는 자궁내막 조직의 DNA 기여 때문입니다. 파일럿 연구에서 이것이 특이성을 손상시키지는 않았지만, 스폰서는 BB가 MAF 신호가 낮은 일부 초기 종양 또는 배경이 높은 매우 나이 많은 여성에서 장애물이 될 수 있음을 인식합니다. 스폰서는 폐경 전 여성의 세척 여과 및 황체기 수집이 BB 신호를 감소시킬 것으로 예상하지만 추가 측정으로 스폰서는 개인의 배경 돌연변이 부하를 정상화하여 성능을 추가로 개선할 수 있는지 여부를 조사할 것입니다. 후원자는 순환하는 백혈구의 TP53 돌연변이 수준이 나이와 같이 BB를 증가시키는 알려진 요인뿐만 아니라 알려지지 않은 돌연변이 유발 노출 또는 사람의 일생 동안 발생하는 기타 요인을 포착하는 경험적으로 측정된 개인 교정기 역할을 할 수 있다고 가정합니다. 백혈구의 DNA는 아마도 UtL의 총 BB 돌연변이 풀에 최소한의 기여만 할 것이지만, 스폰서는 그들이 몸의 다른 곳에서 비례적으로 BB 돌연변이를 대표할 속담인 "탄광의 카나리아" 역할을 할 수 있다고 가정합니다. 종양에 의해 기여된 돌연변이가 알려지지 않은 경우 세척액 자체의 BB 돌연변이 로드는 실제 환경에서 직접 측정할 수 없습니다. 이 개념의 타당성은 일치하는 혈액 샘플의 하위 집합을 포함하고 BB와 연령 사이의 강한 연관성을 나타내는 복막액의 TP53 돌연변이에 대한 초기 연구에서 나타났습니다.

방법: 100개의 HGSC 사례에서 무작위로 선택된 50개와 Aim 1A의 100개 대조군에서 50개를 수술 직전에 수집한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 성분의 DNA를 추출하여 ~10,000x 분자에서 TP53 DS에 적용합니다. 깊이. PBMC의 TP53 돌연변이는 UtL에서 발견된 TP53 돌연변이에서 뺍니다.

통계 분석: 후원사는 UtL과 백혈구의 TP53 돌연변이 빈도 사이의 연관성을 조사하고 목표 1A의 위음성이 백혈구의 BB 증가 사례에 해당하는지 여부를 결정할 것입니다. 또한 스폰서는 백혈구의 TP53 돌연변이 빈도를 케이스 컨트롤 상태의 예측 인자로 분석하고 다시 10% 생략 절차를 사용합니다. 이 혁신적인 보정 방법은 연령과 같은 다른 환자 특성을 기반으로 개발된 조정된 다변량 모델뿐만 아니라 고정된 돌연변이 분율을 사용하는 단변량 모델로 달성된 단순 ROC 메트릭과 비교될 것입니다. 현재 목표와 무관한 과학적 질문으로 후원자는 백혈구 TP53 돌연변이 부하가 환자 연령, 전반적인 건강 또는 돌연변이 유발 노출 이력의 독립적인 예측 인자 역할을 하는지 여부를 확인하기를 간절히 원합니다.

1C를 조준하십시오. 자궁세척과 Pap smear DNA 채취의 진단 성능 비교.

경질 액체 생검에서 난소암 검출을 위해 NGS를 사용하는 첫 번째 보고서는 시퀀싱 기술로 Pap smear 수집 및 SafeSeqS에 의존했습니다. 인용된 41%의 민감도는 중요한 원리 증명을 제공했지만 개선의 여지도 충분했습니다. 스폰서는 SafeSeqS 유사 방법에 비해 DS의 우수한 정확도를 확실히 입증했으며 실험실에서 진행 중인 연구는 UtL에 비해 세포진 검사의 민감도가 제한적임을 나타냅니다. 그러나 동일한 환자에 대한 두 가지 수집 방법의 직접적인 비교는 수행되어야 합니다. Pap smears에 대한 UtL의 우월성 정도를 공식적으로 입증하면 상업적 시장 진입에 도움이 될 것입니다(스폰서는 관련 NCI SBIR이 위에서 언급한 연구의 저자가 설립한 회사인 PapGene Inc에 수여되었음을 언급합니다). UtL은 세척액이 나팔관과 난소 표면에 도달하는 반면 Pap smears는 자궁경관에 도달하는 파종성 암세포에 의존한다는 사실에 근거하여 우월성이 예상됩니다. 그럼에도 불구하고 Pap smears에 대한 TP53 DS가 UtL보다 크게 저하되지 않는 경우 의뢰자는 이 보완 수집 방법을 추가로 탐색할 것입니다. Pap smears는 1차 진료 제공자에 의해 일상적으로 수행되기 때문에 이를 사용할 수 있는 능력은 시장 채택을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 현재의 증거는 자궁 경부 세포진 검사가 열등할 가능성이 있음을 지적합니다.

방법: 스폰서는 위와 같이 TP53 DS를 수행하지만 Aim 1A에서 25개의 암 사례 및 25개의 대조군의 무작위로 선택된 연령 일치 하위 집합의 수술 전에 수집된 Pap smears의 DNA를 사용합니다.

통계 분석: 평균 위험 환자의 하위 샘플에서 기존의 자궁 경부 세포진 검사로 수집한 DNA의 TP53 MAF 데이터는 목표 1A 및 1B 내에서 개발된 모델에서 추가 예측 변수로 간주됩니다. 의뢰자는 사례를 대조군과 구별할 수 있는 추가 권한이 있는지 조사합니다. Pap smears와 UtLs의 정보를 결합하여 얻을 수 있습니다.

목표 2. 고위험 집단 난소암 선별검사 이 목표는 목표 1과 유사한 접근 방식을 취하지만 유전성 유방암 및 난소암(HBOC) 돌연변이로 인해 난소암 위험이 높은 여성에 초점을 맞출 것입니다. HBOC 여성은 유방암 또는 난소암의 강한 가족력으로 확인되고 암 감수성 유전자(보통 BRCA1 및 BRCA2)에 돌연변이가 있는 것으로 밝혀져 평생 HGSC 위험이 35%, 46% 및 13%, 23%, 각기. 치료 표준은 일반적으로 출산이 완료된 후 조기에 위험을 줄이는 난관 난소 절제술(RRSO)입니다. 이 접근법은 사망률을 감소시키지만 불완전합니다. 이 인구에서 난소암의 약 10%가 40세 이전에 발생합니다. 비엔나 사례 시리즈에서 암은 일반적으로 예방 수술을 받기 훨씬 전인 20세의 어린 나이에 나타났습니다. 따라서 표준 치료를 받더라도 가임기의 HBOC 여성은 효과적인 선별 도구에 대한 필요성이 훨씬 더 큰 다른 여성에 비해 난소암 위험이 상당히 높습니다. 현재 영향을 받은 여성은 매우 치명적인 암의 위험 증가를 받아들이거나 출산을 잊거나(또는 조기에 끝내기) 선택해야 합니다. 이것은 미국에서만 수십만 명의 여성이 직면한 극도로 어려운 결정입니다. 특정 인종 그룹, 특히 아슈케나지 유대인에서 보인자가 될 위험은 40명 중 1명입니다. 그러나 대부분의 BRCA 보인자는 수술을 받지 않은 경우에도 HGSC가 발생하지 않습니다. 생명을 구하고 생식력 선택을 보존하기 위해 HGCS 위험이 높은 여성의 조기 진단 진단 도구가 시급합니다. 이 목표의 제품은 그러한 분석의 상업적으로 강력한 성능을 입증하는 115명의 환자 바이오마커 데이터 세트가 될 것입니다.

목표 2A. 고위험 환자의 HGSC 검출을 위해 UtL에서 TP53 DS의 테스트 성능을 평가합니다.

후원자는 목표 1A의 일반적인 방법에 따라 이 연구에 접근할 것입니다. 한 가지 중요한 차이점은 알려진 난소 덩어리가 있는 여성이 아니라 RRSO를 겪고 있는 HBOC 여성에게서 UtL을 수집한다는 것입니다. RRSO 후, 난소와 나팔관은 STIC 및 잠재적 암에 대해 조직, 특히 섬모를 주의 깊게 검사하기 위해 SEE-FIM으로 알려진 세심한 절편 프로토콜을 거칩니다. 이 고위험 인구 중에서 이러한 병변은 절제술의 약 5%에서 발견됩니다. 암 그룹은 SEE-FIM 동안 STIC 또는 잠복 종양이 발견된 여성을 포함할 것이며 대조군 그룹은 병변이 없는 여성을 포함할 것입니다. 이 연구 설계는 고위험 여성뿐만 아니라 특히 외과적으로 치료할 수 있는 매우 초기 단계의 암, 잠재적으로 미세한 암까지 발견할 수 있는 당사 분석의 능력에 초점을 맞춘다는 점에서 혁신적입니다.

방법: 유전성 고위험 난소암 증후군이 있는 최대 115명의 여성의 UtL 샘플을 DS: STIC 또는 잠재적 암이 있는 15명(사례) 및 암이 없는 최대 100명(대조군)을 통해 분석합니다. 케이스와 컨트롤은 연령별로 일치합니다. UtL은 RRSO 직전에 수행됩니다. 수술 표본은 중앙에서 표준화된 SEE-FIM 프로토콜에 의해 병리학적으로 평가됩니다. RRSO 후, 난소와 나팔관은 STIC 및 잠재적 암에 대해 조직, 특히 섬모를 주의 깊게 검사하기 위해 SEE-FIM으로 알려진 세심한 절편 프로토콜을 거칩니다. 스폰서는 이 코호트에서 STIC 또는 잠재 암이 있는 5~15명의 여성을 식별할 것으로 예상하며, 연령이 일치하는 100명의 여성은 발견된 병변이 없을 것입니다. 대조군보다 적은 수의 암 사례는 병변 양성 수술의 낮은 비율과 스폰서 프로젝트가 현실적으로 달성할 수 있는 샘플 수를 반영합니다. 더 많은 수가 최적일지라도 이러한 샘플은 극히 제한적입니다. 암 그룹에는 SEE-FIM 동안 STIC 또는 잠재적 HGSC가 발견된 여성이 포함될 것입니다. 대조군 그룹에는 병변이 없는 여성이 포함될 것입니다. 통계적 분석: 이것은 목표 1A에 따를 것입니다.

조준 2B. 배경 돌연변이 부하에 의한 고위험 여성의 진단 역치 보정.

이 하위 목표는 목표 1B와 동일한 프로토콜 및 통계 방법을 사용하여 목표 2의 고위험 인구에 적용합니다.

방법: 사용 가능한 모든 암 사례의 백혈구 DNA와 대조군의 무작위로 선택된 30명의 여성 하위 집합을 평가합니다. HBOC 여성의 악성 위험이 발암성 돌연변이 발생 가능성을 증가시키는 DNA 복구 결함으로 인해 다른 여성에 비해 높다는 것은 잘 알려져 있습니다. 이와 같이, 스폰서는 말초 혈액뿐만 아니라 UtL에서 측정된 비암 유래 배경 돌연변이 로드도 비례하여 증가할 수 있다고 예상합니다. 혈액에서 측정된 높은 배경 돌연변이 로드를 조정하는 것은 이 그룹의 특이성을 높이는 데 특히 중요할 수 있습니다.

통계 분석: 이는 목표 1B에 따릅니다.

AIM III UtL에서 HGSC 검출을 위한 메틸화 서명을 정의합니다. 지난 15년 동안 특히 암 진단에서 후생유전학적, 종양 특이적 변화의 검출을 위한 DNA 메틸화 분석의 가치가 입증되었습니다. 난소암(OC)의 DNA-메틸화에 대한 연구는 OC 세포가 혈류로 흘리는 DNA 조각(즉, 무세포 DNA - cfDNA)는 cfDNA의 DNA 메틸화 패턴이 진단에 앞서 최대 2년까지 OC의 비율을 감지할 가능성이 있음을 시사합니다. 이 연구는 또한 2년 이내에 최종적으로 고급 장액성 난소암(HGSC)으로 발전한 모든 환자의 50%만이 검출될 수 있었기 때문에 이 접근법의 한계를 분명히 보여줍니다. 근본적인 문제는 혈류 내 cfDNA 농도가 낮기 때문에 매우 약한 신호를 감지해야 한다는 것입니다. HGSC 검출의 민감도를 잠재적으로 증가시키기 위해 후원자는 오스트리아 공과대학(AIT)의 Andreas Weinhäusel 교수와 협력하여 Competence Unit Molecular Diagnostics에 포함된 환자 하위 집합에서 개념 증명 연구를 수행합니다. 이 프로젝트. Andreas Weinhäusel 교수는 HGSC와 관련된 96개의 메틸화 마커를 확인했습니다. DNA 메틸화에는 아주 적은 양의 DNA만 필요합니다. 따라서 시험 절차의 특이성과 민감도를 더욱 발전시키기 위해 본 연구 과정에서 추출한 세척액 및 해당 종양 조직에서 이미 이용 가능한 DNA를 사용하는 것이 좋습니다. AIM3의 제품은 그러한 분석의 고감도 성능을 입증하는 140명의 환자 메틸화 마커 데이터 세트가 될 것입니다.

방법: UtL의 게놈 DNA와 30명의 HGSC 환자 및 10명의 STIC/잠재적 암의 상응하는 종양 조직은 메틸화에 민감한 제한 효소의 도움으로 메틸화된 DNA에 대해 풍부해질 것입니다. 이 DNA는 5 x 96 마커 x 96 DNA가 병렬로 분석되는 highthrough put-qPCR을 수행하여 분석됩니다. 가장 유익한 마커는 메틸화 서명에 결합됩니다. 60개의 컨트롤(30개의 평균 위험 사례 및 30개의 높은 위험 사례)의 UtL에서 시그니처 DNA의 특이성을 증명하기 위해 분석합니다. DNA 메틸화 패턴의 평가는 절제 전 세척액과 최대 10개의 STIC 병변/잠재암에 대해 수행됩니다. 국소 병리학 결과에서 STIC 또는 잠복암 세포(FFPE 조직)가 확인되면 레이저 미세해부 및 DNA 분리가 수행됩니다. 이후에 표준 NGS TP53 시퀀싱을 적용하면 AIM 1 및 AIM 2에 설명된 대로 수행됩니다. 이 파일럿 하위 연구에서는 메틸화 상태를 평가하기 위해 나머지 DNA 물질에 high-through put-qPCR을 적용합니다.

통계 분석: 단순 PCR 테스트를 위한 DNA-메틸화 시그니처 정의 가능성을 평가하기 위해 96-plexed high-throughput MSREqPCR 분석에서 얻은 dCT-PCR 값을 생물정보학 및 생물통계학으로 분석하여 관련 임상 간의 클래스 비교를 수행합니다. 상당히 차등적으로 메틸화된 유전자를 정의하기 위한 서브타입 및 부류; 2) 단일 마커 p-값에 기반한 다양한 특징 선택 접근법을 사용하는 다변량 클래스 예측 분석. 다양한 분류 알고리즘(예: k-최근접 이웃, 지원 벡터 머신, 선형 식별 분석 등)이 적용될 것이며, 최상의 후보 메틸화 마커를 선택하기 위한 10-폴드 교차 검증 및/또는 리브-원-아웃 교차 검증 및 알고리즘을 사용합니다. 또한, 단일 후보 메틸화-마커의 상위-AUC 값은 ROC 분석에서 정의되고 마커 선택을 위해 고려됩니다.

48개의 후보 마커의 하위 집합이 별도의 샘플 세트에서 확인을 위해 선택됩니다. 파생된 메틸화 데이터는 480plexed 분석에서 파생된 첫 번째 데이터 세트와 유사한 방식으로 클래스 비교 및 ​​클래스 예측 분석을 사용하여 분석됩니다. 다변량 분석에서 가장 잘 수행되는 단일 마커 및 마커 조합이 정의됩니다. 분류 결과 및 메틸화 데이터는 단독으로 및 p53 돌연변이 분석과 함께 메틸화 기반 진단 분류의 가능성을 평가하기 위해 p53 돌연변이 테스트 결과와 비교됩니다. 이것은 다변량 모델에서 p53 및 메틸화 데이터를 통합하는 다양한 클래스 예측 접근법을 적용하여 수행됩니다.