Tidlig påvisning af højgradig ovariecancer ved hjælp af livmoderskylning EHUD-undersøgelse og dupleks-sekventering (EHUD)

TILGANGSFASE I University of Washington har demonstreret diagnostisk proof of princip; der er imidlertid behov for yderligere optimering og validering til udrulning i industriel skala. I fase I vil UL-filtreringsmetoden blive optimeret (mål 1), analytisk ydeevne på den kommercielle arbejdsgang valideret (mål 2) og en prøveindsamlingsmilepæl nået (mål 3). Formål 1. Bestem nytten af ​​uterinskylningsfiltrering for at maksimere berigelse for tumorafledt DNA. Foreløbig test med to prøver indikerede, at filtrering af UL'er for at fjerne klynger af endometrieceller kunne øge følsomheden for tumormutationer adskillige gange. Dette datasæt vil blive udvidet ved at analysere filtreringseffekten i 10 UTL'er fra patienter med HGSC med kendte TP53-mutationer. Hver UL vil blive delt i to: den første halvdel vil blive filtreret, og den anden vil forblive ufiltreret. DNA vil blive ekstraheret fra de filtrerede, filtrat og ufiltrerede fraktioner og analyseret med TP53 DS (i alt 30 prøver). For hver UtL vil DNA-udbyttet i hver af fraktionerne og MAF for tumormutationen blive sammenlignet. Det forventes, at den filtrerede fraktion vil indeholde mindre DNA end den ufiltrerede fraktion, men tumormutationen vil være til stede med en højere frekvens. Hvis følsomheden er forbedret (dvs. der opnås mere ved berigelse, end der går tabt ved reduktion fra mindre tilgængeligt DNA), vil filtrering blive brugt på alle fremtidige prøver indsamlet. Mål 2. Validering af optimeret assay: nøjagtighed, præcision, detektionsgrænse og reproducerbarhed. TwinStrand har udviklet et strømlinet DS-workflow ved hjælp af forbedrede adaptere, ligeringskemi og et 96-brønds pladebaseret format med høj gennemstrømning, der kan bruges til væskehåndteringsrobotter og er kompatibelt med CLIA laboratoriestandarder.

TwinStrand har også udviklet en optimeret cloud-baseret analysepipeline, der understøtter automatiseret parallel behandling af flere prøver. Den optimerede proces til påvisning af TP53-mutationer i UL-prøver vil blive valideret. For at vurdere nøjagtighed, teknisk præcision og nedre detektionsgrænse, vil DNA-prøver fra to individer, der adskiller sig i genotype på >5 SNP-steder i eller nær TP53, blive blandet i forhold fra 1:100 1:5.000, to UtL. Blandingerne vil blive sekventeret ved ~10.000x molekylær dybde i to uafhængige eksperimenter. SNP-allelfraktion (AF) vil blive sammenlignet ved forskellige fortyndinger for at bestemme nøjagtighed (forventet AF vs. observeret AF), præcision (AF-variation blandt replikater) og laveste detektionsgrænse, der kan opnås. For at teste assays reproducerbarhed i dens tilsigtede kliniske anvendelse, vil sekventering blive gentaget på de 30 prøver, der anvendes Mål 1, som vil omfatte en bred vifte af tumor MAF'er. Sponsoren vil beregne variationskoefficienten blandt replikater. Baseret på pilotundersøgelser forventer sponsoren fremragende reproducerbarhed (CV<5%). Mål 3. Prøveindsamling. Indsamling af prøver foreslået i fase II vil blive påbegyndt under passende IRB/Etisk Komités godkendelse på hver deltagende institution.

Efter indsamling sendes prøver til Institute for Cancer Research ved Medical University of Vienna, som vil udføre UL-filtrering og DNA-ekstraktion.

Parret DNA fra Pap-smears og perifere leukocytter vil også blive ekstraheret. Isolerede DNA'er vil blive tildelt et identifikationsnummer og sendt til TwinStrand til duplex-sekventering.

Fase I milepæle:

1. Bekræft nytten af ​​UL-filtrering på tumormutationsberigelse.
2. Kvantificer strømlinet assays nøjagtighed, præcision, nedre grænse for detektion og reproducerbarhed på UL'er.
3. Start prøveindsamling til fase II.

Fase I produkter:

1. DS workflow klar til anvendelse på UtL DNA i kommerciel skala i fase II og fase III.
2. Prøvebank for fase II

TILGANGSFASE II Fase II vil validere brugen af ​​TP53 DS på UL'er til tidlig påvisning af ovariecancer i udvidede patientkohorter, der omfatter både gennemsnitlige og højrisikopopulationer. Foruddefinerede parametre, der kan påvirke sensitiviteten og specificiteten af ​​TP53-mutationsfrekvensen, vil blive undersøgt og statistisk modelleret. Klinisk sensitivitet og specificitet vil blive maksimeret ved at bygge personaliserede statistiske diagnostiske tærskelmodeller ved hjælp af multivariate kliniske karakteristika, såvel som hvert individs unikke baggrundsmutationsbelastning baseret på leukocytsekventering. Hos en undergruppe af patienter bekræftes den overlegne ydeevne af UL i forhold til Pap-smear-prøvetagning. Derudover vil et proof of concept-studie blive udført i et undersæt af inkluderede patienter for at studere et sæt af 96 methyleringsmarkører, der er relevante for HGSC i UL'er og tilsvarende tumorvæv/STIC'er.

MÅL 1. GENERELT POPULATION OVARIACANCER SCREENING Dette mål vil udvikle en biomarkør til HGSC-detektion i en gennemsnitlig risikopopulation. Sponsoren vil gennemføre et case-kontrolstudie, der integrerer TP53 DS mutationsdata med klinikpatologisk information for at identificere kvinder med HGSC med maksimal sensitivitet og specificitet. Mere end 98% af HGSC'er bærer mutationer i TP53, hvilket betyder, at ultra-dyb DS kan omkostningseffektivt fokuseres på kun en lille genomisk region. Produktet af dette mål vil være et biomarkørdatasæt på 200 patienter, der viser den omkostningseffektive, kommercielt robuste ydeevne af denne kritisk nødvendige ovariecancerdiagnostik.

Mål 1A: At vurdere testydelsen af ​​TP53 DS på UL'er til HGSC-detektion hos patienter med gennemsnitlig risiko.

Metoder: UL-prøver fra 200 forsøgspersoner fra den gennemsnitlige risikopopulation vil blive analyseret via DS: 100 forsøgspersoner med HGSC (tilfælde) og 100 forsøgspersoner med læsioner, der i sidste ende blev fundet at være godartede efter resektion, dvs. uden cancer (kontroller). Hos alle patienter vil UL blive indsamlet forud for kirurgisk indgreb for en ovariemasse. Lavage vil blive udført i den luteale fase af menstruationscyklussen, hvis den er præmenopausal. Kirurgiske prøver vil blive patologisk vurderet, og en patient vil blive talt som en HGSC-positiv eller en kontrol afhængigt af de histologiske resultater. For cancerpatienter vil den primære tumor blive sekventeret via konventionelle metoder af Medical University of Vienna for et panel af gener, der inkluderer TP53, BRCA1 og BRCA2. For alle de-identificerede patientprøver vil indsamlede kliniske oplysninger omfatte: alder, rygehistorie, tidligere kemoterapieksponering, paritet, overgangsalder, menarkealder, historie med brug af orale præventionsmidler, kræftfamiliehistorie og syv- genmutationsstatus for den primære tumor. Tilfælde og kontroller vil blive aldersmatchede, og et så bredt aldersinterval som muligt vil blive inkluderet for at vurdere effekten af ​​alder på sensitivitet og specificitet.

Statistisk analyse: En detaljeret mutationsprofil for hver prøve vil blive genereret fra duplex-sekventeringsoutputfilerne, herunder: mutant allelfrekvens (MAF) for alle muterede positioner, mutationsspektrum, forudsagt patogenicitet til proteinfunktion, forhold til kendte hotspots og overordnet mutationsbelastning (antal mutantnukleotider divideret med det samlede antal sekventerede nukleotider). Efter dette vil prøverne blive afblændet for tilfælde-kontrolstatus. TP53 MAF fra DNA indsamlet af UtL'er vil blive brugt som prædiktor til at differentiere mellem gennemsnitsrisikopatienter (AIM I) med og uden HGSC ved logistisk regressionsmodellering. Alder, rygehistorie, tidligere eksponering for kemoterapi, paritet, overgangsalder, overgangsalder, alder af menarche, historie med brug af orale præventionsmidler, kræftfamiliehistorie og kimcellemutationsstatus vil blive betragtet som potentielle konfoundere. Modelforudsigelse vil blive vurderet ved krydsvalidering. En analog analyse vil blive anvendt på gruppen af ​​højrisikopatienter (AIM II), hvor tilstedeværelse og fravær af STIC definerer udfaldsvariablen. Afskæringsværdier for mutant allelfrekvens vil blive foreslået i begge tilfælde, og specificitet og sensitivitet vil blive estimeret inklusive passende konfidensintervaller.

Mål 1B: Forbedring af diagnostisk ydeevne med personlig kalibrering ved baggrundsmutationsbelastning.

Den hidtil usete følsomhed af DS førte os og andre til den nye opdagelse, at kræftlignende mutationer akkumuleres på meget lave niveauer med alderen i flere menneskelige væv. I en pilotundersøgelse opdagede sponsoren, at den gennemsnitlige BB-mutationsbelastning er noget højere i UL'er end andre væv, potentielt på grund af DNA-bidrag fra endometrievæv, som replikeres i vid udstrækning før overgangsalderen. Selvom dette ikke kompromitterede specificiteten i pilotstudiet, erkender sponsoren, at BB kunne udgøre en hindring for nogle meget tidlige tumorer, hvor MAF-signalet er lavt, eller med meget ældre kvinder, hvor baggrunden er høj. Sponsoren forventer, at skyllefiltrering og lutealfaseopsamling hos præmenopausale kvinder vil reducere BB-signalet, men som en ekstra foranstaltning vil sponsoren undersøge, om ydeevnen kan forbedres yderligere ved at normalisere for en persons baggrundsmutationsbelastning. Sponsoren antager, at niveauet af TP53-mutationer i cirkulerende leukocytter kan tjene som en empirisk målt personlig kalibrator, der fanger ikke kun kendte faktorer, der øger BB, såsom alder, men også ukendte mutagene eksponeringer eller andre faktorer, der opstår i løbet af en persons liv. Selvom DNA fra leukocytter sandsynligvis kun bidrager med en minimal mængde til den samlede pulje af BB-mutationer i UL'er, antager sponsoren, at de kan tjene som en velsproget "kanariefugl i en kulmine", der vil være proportionelt repræsentativ for BB-mutationer andre steder i kroppen. Selve BB-mutationsbelastningen i en skylning kan ikke måles direkte i en virkelig verden, når mutationen/mutationerne bidraget af en tumor er ukendte. Plausibiliteten af ​​dette koncept blev vist af vores indledende undersøgelse af TP53-mutationer i peritonealvæske, som inkluderede en undergruppe af matchende blodprøver og indikerede en stærk sammenhæng mellem BB og alder.

Metoder: DNA fra komponenten perifere blod mononukleære celler (PBMC) - opsamlet umiddelbart før en operation - af tilfældigt udvalgte 50 fra 100 HGSC-tilfælde og 50 fra 100 kontroller fra mål 1A vil blive ekstraheret og udsat for TP53 DS ved ~10.000x molekylært dybde. TP53-mutationer fra PBMC'er vil blive subtraheret fra TP53-mutationer fundet i UtL.

Statistisk analyse: Sponsoren vil undersøge sammenhængen mellem TP53-mutationsfrekvenser i UtL og leukocytter og vil afgøre, om falske negativer i mål 1A svarer til tilfælde med øget BB i leukocytter. Derudover vil sponsoren analysere TP53-mutationsfrekvenser i leukocytter som en forudsigelse for tilfældets kontrolstatus, igen ved at bruge proceduren for udeladelse af 10 %. Denne innovative kalibreringsmetode vil blive sammenlignet med de simple ROC-metrikker opnået med den univariate model ved brug af en fast mutationsfraktion samt den justerede multivariate model udviklet baseret på andre patientkarakteristika såsom alder. Som et videnskabeligt spørgsmål, der ikke er relateret til de nuværende mål, er sponsoren ivrig efter at se, om leukocyt TP53-mutationsbelastningen vil tjene som en uafhængig forudsigelse af patientens alder, overordnede helbred eller historie med mutagene eksponeringer.

Sigt 1C. Sammenligning af diagnostisk ydeevne af uterinskylning vs. Pap-smear-opsamlet DNA.

Den første rapport om brug af NGS til påvisning af ovariecancer fra en transvaginal væskebiopsi var afhængig af Pap-smear-indsamling og SafeSeqS som sekventeringsteknologi. Den nævnte følsomhed på 41 % gav et vigtigt principbevis, men også rigelig plads til forbedringer. Sponsoren har definitivt demonstreret den overlegne nøjagtighed af DS i forhold til SafeSeqS-lignende metoder og igangværende undersøgelser i vores laboratorium indikerer begrænset følsomhed af Pap-smears sammenlignet med UL. Der mangler dog en direkte sammenligning af de to indsamlingsmetoder på de samme patienter. Formelt demonstration af graden af ​​overlegenhed af UL i forhold til Pap-smears vil hjælpe med kommerciel markedsadgang (sponsoren bemærker, at en relateret NCI SBIR er blevet tildelt PapGene Inc, et firma grundlagt af ovennævnte undersøgelses forfattere). Overlegenheden af ​​UtL forventes baseret på det faktum, at skylningerne når æggelederne og ovarieoverfladerne, hvorimod Pap-smears er afhængige af spredte kræftceller, der når livmoderhalskanalen. Ikke desto mindre, i tilfælde af at TP53 DS på Pap-smears ikke underpræsterer UL drastisk, vil sponsoren undersøge denne supplerende indsamlingsmetode yderligere. Fordi Pap-smears rutinemæssigt udføres af primære udbydere, kan evnen til at bruge disse hjælpe med at fremskynde markedsadoption. Men nuværende beviser peger på den sandsynlige underlegenhed af Pap-smears.

Metoder: Sponsoren vil udføre TP53 DS som ovenfor, men ved hjælp af DNA fra Pap-smears indsamlet før operation af tilfældigt udvalgte, aldersmatchede undergrupper af 25 cancertilfælde og 25 kontroller fra Mål 1A.

Statistisk analyse: Data om TP53 MAF fra DNA indsamlet ved konventionelle pap-smear-tests fra en delprøve af gennemsnitsrisikopatienter vil blive betragtet som yderligere prædiktor i modeller udviklet inden for mål 1A og 1B. Sponsoren vil undersøge, om der er yderligere beføjelser til at skelne tilfælde fra kontroller kan opnås ved at kombinere information fra Pap-smears og UL'er.

MÅL 2. SCREENING AF HØJRISIKO POPULATION OVARIECANCER Dette mål vil have en lignende tilgang til mål 1, men vil fokusere på kvinder med høj risiko for ovariecancer på grund af arvelige bryst- og ovariecancer (HBOC) mutationer. HBOC-kvinder vil være blevet identificeret af en stærk familiehistorie med bryst- eller ovariecancer og fundet at bære mutationer i kræftmodtagelighedsgener, sædvanligvis BRCA1 og BRCA2, som giver en livstids HGSC-risiko på 35 %, 46 % og 13 %, 23 %, henholdsvis. Standard for pleje er risikoreducerende salpingo ooforektomi (RRSO) i en tidlig alder, typisk efter afslutningen af ​​den fødedygtige fødsel. Selvom denne tilgang nedsætter dødeligheden, er den ufuldkommen: ca. 10 % af kræft i æggestokkene i denne befolkning udvikler sig før 40 års alderen. I Wien-sagsserien er kræftsygdomme blevet set i så ung alder som 20 år, hvilket er et godt stykke tid før en profylaktisk operation normalt ville være blevet foretaget. Selv med standardbehandling har HBOC-kvinder i deres reproduktive år en signifikant forhøjet risiko for kræft i æggestokkene i forhold til andre kvinder, og deres behov for et effektivt screeningsværktøj er endnu større. På nuværende tidspunkt skal berørte kvinder træffe beslutningen om enten at acceptere den øgede risiko for en meget dødelig kræftsygdom eller vælge at glemme (eller for tidligt afslutte) fødsel. Dette er en ulidelig udfordrende beslutning, som hundredtusindvis af kvinder står over for alene i USA. I visse etniske grupper, især ashkenazi-jøder, er risikoen for at blive bærer så høj som 1 ud af 40. Alligevel vil størstedelen af ​​BRCA-bærere, selv dem der ikke bliver opereret, aldrig udvikle HGSC. Der er et presserende behov for diagnostiske værktøjer til tidlig detektion hos kvinder med høj risiko for HGCS for at redde liv og bevare valget af fertilitet. Produktet af dette mål vil være et biomarkørdatasæt på 115 patienter, der viser kommercielt robust ydeevne af en sådan analyse.

Mål 2A. At vurdere testydelsen af ​​TP53 DS på UL'er til HGSC-detektion hos højrisikopatienter.

Sponsoren vil nærme sig denne undersøgelse i henhold til de generelle metoder i Mål 1A. En væsentlig forskel er, at UL vil blive indsamlet fra HBOC-kvinder, der gennemgår RRSO, snarere end fra kvinder med kendt ovariemasse. Efter RRSO gennemgår æggestokkene og æggelederne en omhyggelig sektionsprotokol kendt som SEE-FIM for omhyggeligt at undersøge vævene, især fimbriae, for STIC'er og okkulte kræftformer. Blandt denne højrisikopopulation findes sådanne læsioner i omkring 5 % af resektionerne. Kræftgruppen vil omfatte kvinder, hvor STIC eller okkulte tumorer blev fundet under SEE-FIM, kontrolgruppen vil omfatte kvinder uden læsioner. Dette studiedesign er innovativt ved, at det ikke kun fokuserer på højrisikokvinder, men specifikt på vores assays evne til at opdage meget tidlige stadier, potentielt endda mikroskopiske, kræftformer, når de forbliver kirurgisk helbredelige.

Metoder: UL-prøver fra op til 115 kvinder med arvelige højrisiko-ovariecancersyndromer vil blive analyseret via DS: 15 med STIC'er eller okkult cancer (tilfælde) og op til 100 cancerfrie (kontroller). Sag og kontrol vil blive matchet efter alder. UTL'er vil blive udført umiddelbart før RRSO. Kirurgiske prøver vil blive patologisk vurderet ved hjælp af en centralt standardiseret SEE-FIM protokol. Efter RRSO gennemgår æggestokkene og æggelederne en omhyggelig sektionsprotokol kendt som SEE-FIM for omhyggeligt at undersøge vævene, især fimbriae, for STIC'er og okkulte kræftformer. Sponsoren forventer at have identificeret 5 til 15 kvinder med STIC eller okkulte kræftformer i denne kohorte, 100 aldersmatchede kvinder vil ikke have nogen påviste læsioner. Det mindre antal kræfttilfælde end kontroller afspejler den lave procentdel af læsionspositive operationer og det stikprøvetal, som sponsorprojektet realistisk er i stand til at opnå. Selvom et større antal ville være optimalt, er sådanne prøver ekstremt begrænsede. Kræftgruppen vil omfatte kvinder, hvor STIC'er eller okkult HGSC blev fundet under SEE-FIM. Kontrolgruppen vil omfatte kvinder uden læsioner. Statistisk analyse: Dette vil være i henhold til mål 1A.

Mål 2B. Diagnostisk tærskelkalibrering hos højrisikokvinder ved baggrundsmutationsbelastning.

Dette delmål vil bruge den samme protokol og de statistiske metoder som mål 1B og anvende dem på den høj-r i s k population af mål 2.

Metoder: Leukocyt-DNA fra alle tilgængelige cancertilfælde og en tilfældigt udvalgt 30-kvinders undergruppe af kontrolgruppen vil blive evalueret. Det er veletableret, at risikoen for malignitet hos HBOC-kvinder er forhøjet i forhold til andre i kraft af defekter i DNA-reparation, der øger sandsynligheden for, at onkogene mutationer opstår. Som sådan forventer sponsoren, at den ikke-kræftafledte baggrundsmutationsbelastning målt i UL'er såvel som i perifert blod også kan være proportionalt forhøjet. Justering for den høje baggrundsmutationsbelastning målt i blod kan være særlig vigtig for at øge specificiteten i denne gruppe.

Statistisk analyse: Dette vil være i overensstemmelse med mål 1B.

MÅL III At definere en methyleringssignatur til HGSC-detektion i UTL'er. I løbet af de sidste 15 år er værdien af ​​DNA-methyleringsanalyse til påvisning af epigenetiske, tumorspecifikke ændringer blevet påvist, især i cancerdiagnostik. Undersøgelser af DNA-methylering i ovariecancer (OC) fokuserede på at detektere DNA-fragmenter, der udskilles af OC-celler i blodbanen (dvs. cellefrit DNA - cfDNA) tyder på, at DNA-methyleringsmønstre i cfDNA har potentiale til at påvise en andel af OC'er op til to år før diagnosen. Denne undersøgelse viser også tydeligt begrænsningen af ​​denne tilgang, fordi kun 50 % af alle patienter, som endelig udviklede højgradig serøs ovariecancer (HGSC) inden for to år, kunne påvises. Det underliggende problem er, at der på grund af den lave koncentration af cfDNA i blodbanen skal påvises et meget svagt signal. Med det formål potentielt at øge følsomheden af ​​HGSC-detektion vil sponsoren i samarbejde med prof. Andreas Weinhäusel, Austrian Institute of Technology (AIT), Kompetenceenheden Molekylær Diagnostik, udføre et proof of concept-studie i en undergruppe af patienter inkluderet i dette projekt. Prof. Andreas Weinhäusel, identificerede 96 methyleringsmarkører, der er relevante for HGSC. Der kræves kun en meget lille mængde DNA til DNA-methylering. Det er derfor tilrådeligt at bruge det allerede tilgængelige DNA fra skylningerne og det tilsvarende tumorvæv, som er blevet ekstraheret i løbet af denne undersøgelse, til den videre udvikling af testprocedurens specificitet og sensitivitet. Produktet af AIM3 vil være et datasæt med 140 patientmethyleringsmarkører, der demonstrerer høj sensitiv ydeevne af et sådant assay.

Metoder: Genomisk DNA fra UtL'er og tilsvarende tumorvæv fra 30 HGSC-patienter og 10 STIC'er/okkult cancere vil blive beriget for methyleret DNA ved hjælp af methyleringsfølsomme restriktionsenzymer. Dette DNA vil blive analyseret ved at udføre en highthrough put-qPCR, hvor 5 x 96 markør x 96 DNA vil blive analyseret parallelt. De mest informative markører vil blive kombineret til en methyleringssignatur. For at bevise specificiteten af ​​signaturen vil DNA fra UL'er fra 60 kontroller blive analyseret (30 gennemsnitsrisiko og 30 højrisikotilfælde). Vurdering af DNA-methyleringsmønster vil blive udført på præ-resektionsskylningerne og på op til 10 STIC læsioner/okkult cancer. Når lokale patologiske resultater identificerer STIC'er eller okkulte cancerceller (FFPE-væv), udføres lasermikrodissektion og DNA-isolering. Efterfølgende anvendelse af standard NGS TP53-sekventering vil blive udført som beskrevet i AIM 1 og AIM 2. I denne pilot-delundersøgelse vil high-through put-qPCR blive anvendt på resterende DNA-materiale til vurdering af methyleringsstatus.

Statistisk analyse: Med henblik på at evaluere potentialet for at definere en DNA-methyleringssignatur til simpel PCR-testning, vil dCT-PCR-værdier fra 96-plexed high-throughput MSREqPCR-analyse blive analyseret ved hjælp af bioinformatik og biostatistik for at udføre 1) klassesammenligning mellem de relevante kliniske undertyper og klasser til at definere signifikant differentielt methylerede gener; 2) multivariat klasseforudsigelsesanalyse ved hjælp af forskellige funktionsudvælgelsesmetoder baseret på enkeltmarkør p-værdier. Forskellige klassifikationsalgoritmer (f.eks. k-nærmeste nabo, støttevektormaskiner, lineære diskriminationsanalyser osv.) vil blive anvendt ved hjælp af 10-fold krydsvalidering og/eller leave-one-out krydsvalidering til udvælgelse af bedste kandidat methyleringsmarkører - og algoritmer; desuden vil top-AUC-værdierne for enkelte kandidat-methyleringsmarkører blive defineret i ROC-analyse og overvejet til markørudvælgelse.

Et undersæt af 48 kandidatmarkører vil blive udvalgt til bekræftelse i et separat prøvesæt. Methyleringsdataene afledt deraf vil blive analyseret ved anvendelse af klassesammenligning og klasseforudsigelsesanalyse på en lignende måde som det første sæt data afledt fra 480plexed-analyse. Bedst ydende enkeltmarkører og kombinationer af markører fra multivariat analyse vil blive defineret. Klassificeringsresultater og methyleringsdata vil blive sammenlignet med p53-mutationstestresultater for at evaluere potentialet for methyleringsbaseret diagnostisk klassificering, som eneste og i kombination med p53-mutationsanalyse. Dette vil blive udført ved at anvende forskellige klasse-forudsigelsestilgange, der integrerer både p53- og methyleringsdata i multivariate modeller.