Tidlig påvisning av høygradig eggstokkreft ved bruk av livmorskylling EHUD-studie og duplekssekvensering (EHUD)

TILNÆRMING FASE I University of Washington har demonstrert diagnostisk prinsippbevis; ytterligere optimalisering og validering er imidlertid nødvendig for distribusjon i industriell skala. I fase I vil UL-filtreringsmetoden bli optimalisert (Mål 1), analytisk ytelse på den kommersielle arbeidsflyten validert (Mål 2) og en prøveinnsamlingsmilepæl nådd (Mål 3). Mål 1. Bestem nytten av uterinskyllingsfiltrering for å maksimere anrikning for tumoravledet DNA. Foreløpig testing med to prøver indikerte at filtrering av UL-er for å fjerne klynger av endometrieceller kunne øke følsomheten for tumormutasjoner flere ganger. Dette datasettet vil bli utvidet ved å analysere filtreringseffekten i 10 UL-er fra pasienter med HGSC med kjente TP53-mutasjoner. Hver UL vil bli delt i to: den første halvdelen vil bli filtrert og den andre vil forbli ufiltrert. DNA vil bli ekstrahert fra de filtrerte, filtratet og ufiltrerte fraksjonene og analysert med TP53 DS (totalt 30 prøver). For hver UtL vil DNA-utbyttet i hver av fraksjonene og MAF for tumormutasjonen bli sammenlignet. Det er forventet at den filtrerte fraksjonen vil inneholde mindre DNA enn den ufiltrerte fraksjonen, men tumormutasjonen vil være tilstede med en høyere frekvens. Hvis sensitiviteten er forbedret (dvs. mer oppnås ved anrikning enn det som går tapt ved reduksjon fra mindre tilgjengelig DNA), vil filtrering bli brukt på alle fremtidige prøver som samles inn. Mål 2. Validering av optimalisert analyse: nøyaktighet, presisjon, deteksjonsgrense og reproduserbarhet. TwinStrand har utviklet en strømlinjeformet DS-arbeidsflyt ved bruk av forbedrede adaptere, ligeringskjemi og et platebasert format med høy gjennomstrømning på 96 brønner som er tilgjengelig for væskehåndteringsroboter og er kompatibelt med CLIA-laboratoriestandarder.

TwinStrand har også utviklet en optimert skybasert analysepipeline som støtter automatisert parallell prosessering av flere prøver. Den optimaliserte prosessen for påvisning av TP53-mutasjoner i UL-prøver vil bli validert. For å vurdere nøyaktighet, teknisk presisjon og nedre deteksjonsgrense, vil DNA-prøver fra to individer som er forskjellige i genotype på >5 SNP-steder i eller nær TP53 blandes, i forhold fra 1:100 1:5000, to UtL. Blandingene vil bli sekvensert ved ~10.000x molekyldybde i to uavhengige eksperimenter. SNP allelfraksjon (AF) vil bli sammenlignet ved forskjellige fortynninger for å bestemme nøyaktighet (forventet AF vs. observert AF), presisjon (AF-variasjon blant replikater) og laveste deteksjonsgrense som er oppnåelig. For å teste analysens reproduserbarhet i den tiltenkte kliniske bruken, vil sekvensering bli gjentatt på de 30 prøvene som brukes Mål 1, som vil omfatte et bredt spekter av tumor MAF. Sponsoren vil beregne variasjonskoeffisienten mellom replikater. Basert på pilotstudier forventer sponsoren utmerket reproduserbarhet (CV<5%). Mål 3. Prøveinnsamling. Innsamling av prøver foreslått i fase II vil bli startet under passende IRB/Etisk komité-godkjenning ved hver deltakende institusjon.

Etter innsamling sendes prøver til Institutt for kreftforskning ved det medisinske universitetet i Wien som vil utføre UL-filtrering og DNA-ekstraksjon.

Paret DNA fra celleprøver og perifere leukocytter vil også bli ekstrahert. Isolerte DNA-er vil bli tildelt et identifikasjonsnummer og sendt til TwinStrand for duplekssekvensering.

Fase I-milepæler:

1. Bekreft nytten av UtL-filtrering på tumormutasjonsanrikning.
2. Kvantifiser strømlinjeformet analyses nøyaktighet, presisjon, nedre grense for deteksjon og reproduserbarhet på UL-er.
3. Start prøveinnsamling for fase II.

Fase I-produkter:

1. DS arbeidsflyt klar for bruk på UtL DNA i kommersiell skala i fase II og fase III.
2. Prøvebank for fase II

TILNÆRMING FASE II Fase II vil validere bruken av TP53 DS på UL-er for tidlig påvisning av eggstokkreft i utvidede pasientkohorter for pasientkontroll som omfatter både gjennomsnittlige og høyrisikopopulasjoner. Forhåndsdefinerte parametere som kan påvirke sensitiviteten og spesifisiteten til TP53-mutasjonsfrekvensen vil bli undersøkt og statistisk modellert. Klinisk sensitivitet og spesifisitet vil bli maksimert ved å bygge personlige statistiske diagnostiske terskelmodeller ved bruk av multivariate kliniske karakteristikker, samt hver enkelts unike bakgrunnsmutasjonsbelastning basert på leukocyttsekvensering. Hos en undergruppe av pasienter vil den overlegne ytelsen til UtL over celleprøvetaking bli bekreftet. I tillegg vil en proof of concept-studie bli utført i et undersett av inkluderte pasienter for å studere et sett med 96 metyleringsmarkører som er relevante for HGSC i UtLs og tilsvarende tumorvev/STICs.

MÅL 1. GENERELL POPULASJON SCREENING AV OVARIACANCER Dette målet vil utvikle en biomarkør for HGSC-deteksjon i en gjennomsnittlig risikopopulasjon. Sponsoren vil gjennomføre en casekontrollstudie som integrerer TP53 DS mutasjonsdata med klinikkpatologisk informasjon for å identifisere kvinner med HGSC med maksimal sensitivitet og spesifisitet. Mer enn 98% av HGSC-er bærer mutasjoner i TP53, noe som betyr at ultra-dyp DS kan kostnadseffektivt fokuseres på bare en liten genomisk region. Produktet av dette målet vil være et sett med biomarkører for 200 pasienter som viser den kostnadseffektive, kommersielt robuste ytelsen til denne kritisk nødvendige diagnostikken for eggstokkreft.

Mål 1A: Å vurdere testytelsen til TP53 DS på UL-er for HGSC-deteksjon hos pasienter med gjennomsnittlig risiko.

Metoder: UtL-prøver fra 200 personer fra gjennomsnittlig risikopopulasjon vil bli analysert via DS: 100 personer med HGSC (tilfeller) og 100 personer med lesjoner som til slutt ble funnet å være godartede etter reseksjon, dvs. uten kreft (kontroller). Hos alle pasienter vil UL bli samlet inn før kirurgisk inngrep for en ovariemasse. Skylling vil bli utført under lutealfasen av menstruasjonssyklusen hvis den er premenopausal. Kirurgiske prøver vil bli patologisk vurdert, og en pasient vil bli regnet som HGSC-positiv eller en kontroll avhengig av de histologiske resultatene. For kreftpasienter vil primærtumoren bli sekvensert via konvensjonelle metoder av Medical University of Vienna for et panel av gener som inkluderer TP53, BRCA1 og BRCA2. For alle avidentifiserte pasientprøver vil innsamlet klinisk informasjon inkludere: alder, røykehistorie, tidligere kjemoterapieksponering, paritet, overgangsalder, menarkealder, historie med bruk av p-piller, kreftfamiliehistorie og syv- genmutasjonsstatus for primærsvulsten. Tilfeller og kontroller vil bli alderstilpasset og et så bredt aldersspekter som mulig vil bli inkludert for å vurdere effekten av alder på sensitivitet og spesifisitet.

Statistisk analyse: En detaljert mutasjonsprofil for hver prøve vil bli generert fra utdatafilene for duplekssekvensering, inkludert: mutant allelfrekvens (MAF) for alle muterte posisjoner, mutasjonsspektrum, predikert patogenisitet til proteinfunksjon, forhold til kjente hotspots og total mutasjonsbelastning (antall mutante nukleotider delt på totalt antall sekvenserte nukleotider). Etter dette vil prøvene bli deaktivert for status for tilfeller-kontroller. TP53 MAF fra DNA samlet inn av UtLs vil bli brukt som prediktor for å skille mellom gjennomsnittlig risikopasienter (AIM I) med og uten HGSC ved logistisk regresjonsmodellering. Alder, røykehistorie, tidligere kjemoterapieksponering, paritet, overgangsalder, overgangsalder, historie med p-piller, kreftfamilieanamnese og kjønnscellemutasjonsstatus vil bli vurdert som potensielle konfoundere. Modellprediksjon vil bli vurdert ved kryssvalidering. En analog analyse vil bli brukt på gruppen av høyrisikopasienter (AIM II) der tilstedeværelse og fravær av STIC definerer utfallsvariabelen. Avskjæringsverdier for mutant allelfrekvens vil bli foreslått i begge tilfeller, og spesifisitet og sensitivitet vil bli estimert inkludert passende konfidensintervaller.

Mål 1B: Forbedre diagnostisk ytelse med personlig kalibrering ved bakgrunnsmutasjonsbelastning.

Den enestående følsomheten til DS førte oss og andre til den nye oppdagelsen at kreftlignende mutasjoner akkumuleres på svært lave nivåer med alderen i flere menneskelige vev. I en pilotstudie oppdaget sponsoren at den gjennomsnittlige BB-mutasjonsbelastningen er noe høyere i ULs enn andre vev, potensielt på grunn av DNA-bidrag fra endometrievev, som replikerer mye før overgangsalderen. Selv om dette ikke kompromitterte spesifisiteten i pilotstudien, erkjenner sponsoren at BB kan utgjøre en hindring for noen svært tidlige svulster der MAF-signalet er lavt, eller med svært eldre kvinner der bakgrunnen er høy. Sponsoren forventer at skyllefiltrering og lutealfaseinnsamling hos premenopausale kvinner vil redusere BB-signalet, men som et ekstra tiltak vil sponsoren undersøke om ytelsen kan forbedres ytterligere ved å normalisere for et individs bakgrunnsmutasjonsbelastning. Sponsoren antar at nivået av TP53-mutasjoner i sirkulerende leukocytter kan tjene som en empirisk målt personlig kalibrator som fanger opp, ikke bare kjente faktorer som øker BB, som alder, men også ukjente mutagene eksponeringer eller andre faktorer som oppstår i løpet av en persons liv. Selv om DNA fra leukocytter sannsynligvis bare bidrar med en minimal mengde til den totale mengden av BB-mutasjoner i UtLs, antar sponsoren at de kan tjene som en velkjent "kanarifugl i en kullgruve" som vil være proporsjonalt representativ for BB-mutasjoner andre steder i kroppen. BB-mutasjonsbelastningen i en lavage, i seg selv, kan ikke måles direkte i en virkelig verden når mutasjonen(e) bidratt av en svulst er ukjent. Plausibiliteten til dette konseptet ble vist av vår første studie av TP53-mutasjoner i peritonealvæske, som inkluderte en undergruppe av matchende blodprøver og indikerte en sterk assosiasjon mellom BB og alder.

Metoder: DNA fra komponenten perifere blod mononukleære celler (PBMC) - samlet umiddelbart før en operasjon - av tilfeldig utvalgte 50 fra 100 HGSC-tilfeller og 50 fra 100 kontroller fra mål 1A vil bli ekstrahert og utsatt for TP53 DS ved ~10 000x molekylær dybde. TP53-mutasjoner fra PBMC-er vil bli trukket fra TP53-mutasjoner funnet i UtL.

Statistisk analyse: Sponsoren vil undersøke assosiasjonen mellom TP53-mutasjonsfrekvenser i UtL og leukocytter og vil avgjøre om falske negativer i mål 1A samsvarer med tilfeller med økt BB i leukocytter. I tillegg vil sponsoren analysere TP53-mutasjonsfrekvenser i leukocytter som en prediktor for sakskontrollstatus, igjen ved å bruke utelatelse 10 %-prosedyren. Denne innovative kalibreringsmetoden vil bli sammenlignet med de enkle ROC-metrikkene oppnådd med den univariate modellen ved bruk av en fast mutasjonsfraksjon samt den justerte multivariate modellen utviklet basert på andre pasientkarakteristikker som alder. Som et vitenskapelig spørsmål som ikke er relatert til de nåværende målene, er sponsoren ivrig etter å se om leukocytt TP53-mutasjonsbelastning vil tjene som en uavhengig prediktor for pasientens alder, generell helse eller historie med mutagene eksponeringer.

Mål 1C. Sammenligning av diagnostisk ytelse av livmorskylling vs. celleprøve-samlet DNA.

Den første rapporten om bruk av NGS for påvisning av eggstokkreft fra en transvaginal væskebiopsi var avhengig av celleprøveinnsamling og SafeSeqS som sekvenseringsteknologi. Den oppgitte sensitiviteten på 41 % ga et viktig prinsippbevis, men også stort rom for forbedring. Sponsoren har definitivt demonstrert den overlegne nøyaktigheten til DS over SafeSeqS-lignende metoder og pågående studier i laboratoriet vårt indikerer begrenset følsomhet av celleprøver sammenlignet med UtL. Det gjenstår imidlertid en direkte sammenligning av de to innsamlingsmetodene på samme pasienter. Å formelt demonstrere graden av overlegenhet til UtL over celleprøver vil hjelpe med kommersiell markedsinngang (sponsoren bemerker at en relatert NCI SBIR har blitt tildelt PapGene Inc, et selskap grunnlagt av forfatterne av ovennevnte studie). Overlegenheten til UtL forventes basert på det faktum at skyllingene når egglederne og eggstokkene, mens celleprøver er avhengige av spredte kreftceller som når livmorhalskanalen. Likevel, i tilfelle TP53 DS på celleprøver ikke underpresterer UL drastisk, vil sponsoren utforske denne komplementære innsamlingsmetoden ytterligere. Fordi celleprøver rutinemessig utføres av primærhelsepersonell, kan muligheten til å bruke disse bidra til å akselerere markedsadopsjon. Nåværende bevis peker imidlertid på den sannsynlige underlegenheten til celleprøver.

Metoder: Sponsoren vil utføre TP53 DS som ovenfor, men ved å bruke DNA fra celleprøver samlet inn før operasjon av tilfeldig utvalgte, alderstilpassede undergrupper av 25 krefttilfeller og 25 kontroller fra Mål 1A.

Statistisk analyse: Data om TP53 MAF fra DNA samlet inn ved konvensjonelle celleprøver fra en delprøve av pasienter med gjennomsnittlig risiko vil bli vurdert som en tilleggsprediktor i modeller utviklet innenfor mål 1A og 1B. Sponsoren vil undersøke om det er noen ytterligere makt til å diskriminere tilfeller fra kontroller. kan oppnås ved å kombinere informasjon fra celleprøver og utls.

MÅL 2. HØYRISIKO POPULASJON SCREENING AV OVARIACANCER Dette målet vil ha en lignende tilnærming til mål 1, men vil fokusere på kvinner med høy risiko for eggstokkreft på grunn av arvelige mutasjoner i bryst- og eggstokkreft (HBOC). HBOC-kvinner vil ha blitt identifisert av en sterk familiehistorie med bryst- eller eggstokkreft og funnet å bære mutasjoner i kreftmottaksgener, vanligvis BRCA1 og BRCA2, som gir en livslang HGSC-risiko på 35 %, 46 % og 13 %, 23 %, hhv. Standard for omsorg er risikoreduserende salpingo-ooforektomi (RRSO) i tidlig alder, vanligvis etter fullført fødsel. Selv om denne tilnærmingen reduserer dødeligheten, er den ufullkommen: omtrent 10 % av eggstokkreftene i denne populasjonen utvikler seg før 40 år. I Vienna case-serien har kreft blitt sett i så ung alder som 20 år, som er godt før en profylaktisk operasjon normalt ville blitt utført. Selv med standard omsorg, har HBOC-kvinner i sine reproduktive år en betydelig forhøyet risiko for eggstokkreft i forhold til andre kvinner, deres behov for et effektivt screeningsverktøy er enda større. For tiden må berørte kvinner ta avgjørelsen om enten å akseptere den økte risikoen for en svært dødelig kreft eller velge å glemme (eller for tidlig avslutte) fødselen. Dette er en uutholdelig utfordrende avgjørelse møtt av hundretusenvis av kvinner alene i USA. I visse etniske grupper, spesielt ashkenazi-jøder, er risikoen for å være bærer så høy som 1 av 40. Likevel vil flertallet av BRCA-bærere, selv de som ikke har kirurgi, aldri utvikle HGSC. Det er et presserende behov for diagnostiske verktøy for tidlig oppdagelse hos kvinner med høy risiko for HGCS for å redde liv og bevare valget av fruktbarhet. Produktet av dette målet vil være et datasett med 115 pasienter med biomarkører som viser kommersielt robust ytelse av en slik analyse.

Mål 2A. For å vurdere testytelsen til TP53 DS på UL-er for HGSC-deteksjon hos høyrisikopasienter.

Sponsoren vil nærme seg denne studien i henhold til de generelle metodene i Mål 1A. En vesentlig forskjell er at UtL vil bli samlet inn fra HBOC-kvinner som gjennomgår RRSO, i stedet for fra kvinner med kjente ovariemasser. Etter RRSO gjennomgår eggstokkene og egglederne en omhyggelig seksjoneringsprotokoll kjent som SEE-FIM for å nøye undersøke vevet, spesielt fimbriae, for STIC og okkulte kreftformer. Blant denne høyrisikopopulasjonen finnes slike lesjoner i omtrent 5 % av reseksjonene. Kreftgruppen vil omfatte kvinner der STIC eller okkulte svulster ble funnet under SEE-FIM, kontrollgruppen vil inkludere kvinner uten lesjoner. Denne studiedesignen er nyskapende ved at den fokuserer, ikke bare på kvinner med høy risiko, men spesifikt på evnen til analysen vår til å oppdage svært tidlige stadier, potensielt til og med mikroskopiske, kreftformer når de forblir kirurgisk helbredelige.

Metoder: UtL-prøver fra opptil 115 kvinner med arvelig høyrisiko eggstokkreftsyndrom vil bli analysert via DS: 15 med STIC eller okkult kreft (tilfeller) og opptil 100 kreftfrie (kontroller). Sak og kontroll vil bli matchet etter alder. UtLs vil bli utført umiddelbart før RRSO. Kirurgiske prøver vil bli patologisk vurdert ved hjelp av en sentralt standardisert SEE-FIM-protokoll. Etter RRSO gjennomgår eggstokkene og egglederne en omhyggelig seksjoneringsprotokoll kjent som SEE-FIM for å nøye undersøke vevet, spesielt fimbriae, for STIC og okkulte kreftformer. Sponsoren forventer å ha identifisert 5 til 15 kvinner med STIC eller okkulte kreftformer i denne kohorten, 100 alderstilpassede kvinner vil ikke ha noen påviste lesjoner. Det mindre antallet krefttilfeller enn kontroller reflekterer den lave prosentandelen av lesjonspositive operasjoner og prøveantallet sponsorprosjektet realistisk kan oppnå. Selv om et større antall ville være optimalt, er slike prøver ekstremt begrensede. Kreftgruppen vil omfatte kvinner der STIC eller okkult HGSC ble funnet under SEE-FIM. Kontrollgruppen vil inkludere kvinner uten lesjoner Statistisk analyse: Dette vil være i henhold til mål 1A.

Mål 2B. Diagnostisk terskelkalibrering hos kvinner med høy risiko ved bakgrunnsmutasjonsbelastning.

Dette delmålet vil bruke samme protokoll og statistiske metoder for mål 1B og anvende dem på den høye r i s k-populasjonen i mål 2.

Metoder: Leukocytt-DNA fra alle tilgjengelige krefttilfeller og en tilfeldig valgt 30-kvinners undergruppe av kontrollgruppen vil bli evaluert. Det er veletablert at risikoen for malignitet hos HBOC-kvinner er forhøyet i forhold til andre på grunn av defekter i DNA-reparasjon som øker sannsynligheten for at onkogene mutasjoner oppstår. Som sådan forventer sponsoren at den ikke-kreftavledede bakgrunnsmutasjonsbelastningen målt i ULs så vel som i perifert blod også kan være proporsjonalt forhøyet. Å justere for den høye bakgrunnsmutasjonsbelastningen målt i blod kan være spesielt viktig for å øke spesifisiteten i denne gruppen.

Statistisk analyse: Dette vil være i henhold til mål 1B.

MÅL III Å definere en metyleringssignatur for HGSC-deteksjon i ULS. I løpet av de siste 15 årene har verdien av DNA-metyleringsanalyse for påvisning av epigenetiske, svulstspesifikke endringer blitt demonstrert, spesielt innen kreftdiagnostikk. Studier av DNA-metylering i eggstokkreft (OC) fokuserte på å oppdage DNA-fragmenter som ble kastet av OC-celler i blodet (dvs. cellefritt DNA - cfDNA) tyder på at DNA-metyleringsmønstre i cfDNA har potensial til å oppdage en andel av OC opptil to år før diagnosen. Denne studien viser også tydelig begrensningene ved denne tilnærmingen fordi bare 50 % av alle pasienter som til slutt utviklet høygradig serøs eggstokkreft (HGSC) innen to år, kunne oppdages. Det underliggende problemet er at på grunn av den lave konsentrasjonen av cfDNA i blodstrømmen, må et veldig svakt signal oppdages. Med sikte på å potensielt øke sensitiviteten til HGSC-deteksjon vil sponsoren i samarbeid med prof. Andreas Weinhäusel, Austrian Institute of Technology (AIT), kompetanseenheten Molecular Diagnostics, utføre en proof of concept-studie i en undergruppe av pasienter inkludert i dette prosjektet. Prof. Andreas Weinhäusel, identifiserte 96 metyleringsmarkører som er relevante for HGSC. Bare en svært liten mengde DNA er nødvendig for DNA-metylering. Det er derfor tilrådelig å bruke allerede tilgjengelig DNA fra skyllingene og det tilsvarende tumorvevet, som har blitt ekstrahert i løpet av denne studien, for videreutvikling av spesifisiteten og sensitiviteten til testprosedyren. Produktet til AIM3 vil være et datasett med 140 pasientmetyleringsmarkører som viser høysensitiv ytelse av en slik analyse.

Metoder: Genomisk DNA fra UtLs og tilsvarende tumorvev fra 30 HGSC-pasienter og 10 STICs/okkult kreftformer vil bli anriket for metylert DNA ved hjelp av metyleringssensitive restriksjonsenzymer. Dette DNAet vil bli analysert ved å utføre en highthrough put-qPCR der 5 x 96 markør x 96 DNA vil bli analysert parallelt. De mest informative markørene vil bli kombinert til en metyleringssignatur. For å bevise spesifisiteten til signaturen vil DNA fra UL-er fra 60 kontroller bli analysert (30 gjennomsnittlig risiko og 30 høyrisikotilfeller). Vurdering av DNA-metyleringsmønster vil bli utført på pre-reseksjonsskyllingene og på opptil 10 STIC-lesjoner/okkult kreft. Når lokale patologiresultater identifiserer STIC eller okkulte kreftceller (FFPE-vev), vil lasermikrodisseksjon og DNA-isolering bli utført. Påfølgende bruk av standard NGS TP53-sekvensering vil bli utført som beskrevet i AIM 1 og AIM 2. I denne pilot-delstudien vil high-through put-qPCR bli brukt på gjenværende DNA-materiale for vurdering av metyleringsstatus.

Statistisk analyse: Med sikte på å evaluere potensialet for å definere en DNA-metyleringssignatur for enkel PCR-testing, vil dCT-PCR-verdier fra 96-plexed high-throughput MSREqPCR-analyse bli analysert av bioinformatikk og biostatistikk for å gjennomføre 1) klassesammenlikning mellom de relevante kliniske undertyper og klasser for å definere signifikant differensielt metylerte gener; 2) multivariat klasseprediksjonsanalyse ved bruk av ulike funksjonsvalgtilnærminger basert på enkeltmarkør-p-verdier. Ulike klassifiseringsalgoritmer (f.eks. k-nærmeste nabo, støttevektormaskiner, lineære diskrimineringsanalyser etc.) vil bli brukt, ved å bruke 10-gangers kryssvalidering og/eller utelate-en-ut kryssvalidering for å velge beste kandidat-metyleringsmarkører - og algoritmer; i tillegg vil topp-AUC-verdiene for enkeltkandidat-metyleringsmarkører bli definert i ROC-analyse og vurdert for markørvalg.

Et undersett av 48 kandidatmarkører vil bli valgt for bekreftelse i et eget prøvesett. Metyleringsdataene avledet derav vil bli analysert ved bruk av klassesammenligning og klasseprediksjonsanalyse på lignende måte som det første settet med data avledet fra 480plexed-analyse. Enkeltmarkører med best ytelse og kombinasjoner av markører fra multivariat analyse vil bli definert. Klassifiseringsresultater og metyleringsdata vil bli sammenlignet med p53-mutasjonstestresultater for å evaluere potensialet for metyleringsbasert diagnostisk klassifisering, som eneste og i kombinasjon med p53-mutasjonsanalyse. Dette vil bli utført ved å bruke forskjellige klasseprediksjonstilnærminger som integrerer både p53 og metyleringsdata i multivariate modeller.