Wczesne wykrywanie raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości za pomocą płukania macicy Badanie EHUD i sekwencjonowanie dupleksowe (EHUD)

PODEJŚCIE FAZA I Uniwersytet Waszyngtoński wykazał diagnostyczny dowód zasady; jednak do wdrożenia na skalę przemysłową potrzebna jest dalsza optymalizacja i weryfikacja. W Fazie I metoda filtracji UtL zostanie zoptymalizowana (Cel 1), zwalidowana wydajność analityczna w komercyjnym przepływie pracy (Cel 2) i osiągnięty zostanie kamień milowy pobierania próbek (Cel 3). Cel 1. Określenie przydatności filtracji popłuczyn macicy do maksymalizacji wzbogacenia DNA pochodzącego z guza. Wstępne testy z dwiema próbkami wykazały, że filtracja UtL w celu usunięcia skupisk komórek endometrium może kilkukrotnie zwiększyć wrażliwość na mutacje guza. Ten zestaw danych zostanie rozszerzony poprzez analizę efektu filtracji w 10 UtL od pacjentów z HGSC ze znanymi mutacjami TP53. Każdy UtL zostanie podzielony na pół: pierwsza połowa zostanie przefiltrowana, a druga pozostanie niefiltrowana. DNA zostanie wyekstrahowane z przefiltrowanych, przesączowych i niefiltrowanych frakcji i przeanalizowane za pomocą TP53 DS (łącznie 30 próbek). Dla każdego UtL porównana zostanie wydajność DNA w każdej z frakcji i MAF mutacji guza. Przewiduje się, że filtrowana frakcja będzie zawierała mniej DNA niż frakcja niefiltrowana, ale mutacja guza będzie występować z większą częstotliwością. Jeśli poprawi się czułość (tj. więcej zyska się na wzbogaceniu niż straci na redukcji z mniej dostępnego DNA), filtracja zostanie zastosowana we wszystkich zebranych w przyszłości próbkach. Cel 2. Walidacja zoptymalizowanego testu: dokładność, precyzja, granica wykrywalności i odtwarzalność. Firma TwinStrand opracowała usprawniony przepływ pracy DS, wykorzystując ulepszone adaptery, chemię ligacji i wysokowydajny format oparty na płytkach 96-dołkowych, nadający się do pracy z robotami obsługującymi ciecze i zgodny ze standardami laboratoryjnymi CLIA.

Firma TwinStrand opracowała również zoptymalizowany potok analiz oparty na chmurze, który obsługuje automatyczne przetwarzanie równoległe wielu próbek. Zoptymalizowany proces wykrywania mutacji TP53 w próbkach UtL zostanie poddany walidacji. Aby ocenić dokładność, precyzję techniczną i dolną granicę wykrywalności, próbki DNA od dwóch osobników różniących się genotypem w >5 miejscach SNP w TP53 lub w jego pobliżu zostaną zmieszane w proporcjach od 1:100 do 1:5000, dwa UtL. Mieszaniny zostaną zsekwencjonowane na ~10 000-krotnej głębokości molekularnej w dwóch niezależnych eksperymentach. Frakcja alleli SNP (AF) zostanie porównana w różnych rozcieńczeniach w celu określenia dokładności (oczekiwane AF vs obserwowane AF), precyzji (zmienność AF między powtórzeniami) i najniższej osiągalnej granicy wykrywalności. Aby przetestować odtwarzalność testu w zamierzonym zastosowaniu klinicznym, sekwencjonowanie zostanie powtórzone na 30 użytych próbkach Cel 1, który obejmie szeroki zakres MAF guza. Sponsor obliczy współczynnik zmienności wśród powtórzeń. Na podstawie badań pilotażowych Sponsor przewiduje doskonałą odtwarzalność (CV<5%). Cel 3. Pobranie próbki. Pobieranie próbek zaproponowanych w Fazie II zostanie rozpoczęte po uzyskaniu odpowiedniej zgody IRB/Komitetu ds. Etyki w każdej uczestniczącej instytucji.

Po pobraniu próbki są wysyłane do Instytutu Badań nad Rakiem na Uniwersytecie Medycznym w Wiedniu, który przeprowadzi filtrację UtL i ekstrakcję DNA.

Wyodrębnione zostanie również sparowane DNA z wymazów cytologicznych i leukocytów obwodowych. Wyizolowanym DNA zostanie nadany numer identyfikacyjny i wysłany do TwinStrand w celu sekwencjonowania dupleksowego.

Kamienie milowe fazy I:

1. Potwierdź przydatność filtracji UtL do wzbogacania mutacji guza.
2. Kwantyfikuj dokładność usprawnionego testu, precyzję, dolną granicę wykrywalności i odtwarzalność na UtL.
3. Rozpocznij pobieranie próbek do Fazy II.

Produkty fazy I:

1. Przepływ pracy DS gotowy do zastosowania w UtL DNA na skalę komercyjną w fazie II i fazie III.
2. Bank próbek dla fazy II

PODEJŚCIE FAZA II Faza II zwaliduje zastosowanie TP53 DS na UtL do wczesnego wykrywania raka jajnika w rozszerzonej grupie kontrolnej pacjentów obejmującej populacje średniego i wysokiego ryzyka. Predefiniowane parametry, które mogą wpływać na czułość i swoistość częstości mutacji TP53, zostaną zbadane i poddane modelowaniu statystycznemu. Czułość i specyficzność kliniczna zostanie zmaksymalizowana poprzez zbudowanie spersonalizowanych modeli statystycznych progów diagnostycznych z wykorzystaniem wielowymiarowych cech klinicznych, a także unikalnego ładunku mutacji tła każdej osoby w oparciu o sekwencjonowanie leukocytów. W podgrupie pacjentów potwierdzona zostanie lepsza skuteczność pobierania wymazu UtL w porównaniu z badaniem cytologicznym. Ponadto w podgrupie włączonych pacjentów zostanie przeprowadzone badanie sprawdzające słuszność koncepcji w celu zbadania zestawu 96 markerów metylacji istotnych dla HGSC w UtL i odpowiadających im tkankach nowotworowych/STIC.

CEL 1. BADANIE PRZESIEWOWE W kierunku RAKA JAJNIKA W OGÓLNEJ POPULACJI Celem jest opracowanie biomarkera do wykrywania HGSC w populacji o średnim ryzyku. Sponsor przeprowadzi badanie kliniczno-kontrolne, które połączy dane dotyczące mutacji TP53 DS z klinicznymi informacjami patologicznymi w celu zidentyfikowania kobiet z HGSC z maksymalną czułością i specyficznością. Ponad 98% HGSC jest nosicielami mutacji w TP53, co oznacza, że ​​ultra-głęboka DS może być efektywnie kosztowo skupiona tylko na małym regionie genomu. Produktem tego celu będzie zestaw danych biomarkerów 200 pacjentów, który wykaże opłacalną, komercyjnie solidną wydajność tej niezwykle potrzebnej diagnostyki raka jajnika.

Cel 1A: Ocena wydajności testu TP53 DS na UtL do wykrywania HGSC u pacjentów o średnim ryzyku.

Metody: Próbki UtL od 200 osób z populacji średniego ryzyka zostaną przeanalizowane za pomocą DS: 100 osób z HGSC (przypadki) i 100 osób ze zmianami, które ostatecznie uznano za łagodne po resekcji, tj. bez raka (grupa kontrolna). U wszystkich pacjentek UtL zostanie pobrane przed interwencją chirurgiczną w celu usunięcia guza jajnika. Płukanie zostanie przeprowadzone w fazie lutealnej cyklu miesiączkowego, jeśli występuje przed menopauzą. Próbki chirurgiczne zostaną ocenione patologicznie, a pacjent zostanie zaliczony jako HGSC dodatni lub jako kontrola, w zależności od wyników histologicznych. W przypadku pacjentów z rakiem guz pierwotny zostanie zsekwencjonowany konwencjonalnymi metodami przez Uniwersytet Medyczny w Wiedniu pod kątem panelu genów, który obejmuje TP53, BRCA1 i BRCA2. W przypadku wszystkich pozbawionych elementów identyfikacyjnych próbek pacjentów zebrane informacje kliniczne będą obejmować: wiek, historię palenia tytoniu, wcześniejszą ekspozycję na chemioterapię, liczbę porodów, wiek menopauzy, wiek pierwszej miesiączki, historię stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych, wywiad rodzinny w kierunku raka oraz siedmio- status mutacji genu guza pierwotnego. Przypadki i kontrole zostaną dopasowane pod względem wieku i uwzględniony zostanie możliwie najszerszy przedział wiekowy, aby ocenić wpływ wieku na czułość i swoistość.

Analiza statystyczna: szczegółowy profil mutacji dla każdej próbki zostanie wygenerowany na podstawie plików wyjściowych sekwencjonowania dupleksu, w tym: częstotliwość alleli mutacji (MAF) dla wszystkich zmutowanych pozycji, spektrum mutacji, przewidywana patogeniczność funkcji białka, związek ze znanymi punktami aktywnymi i ogólne obciążenie mutacją (liczba zmutowanych nukleotydów podzielona przez całkowitą liczbę zsekwencjonowanych nukleotydów). Następnie próbki zostaną odślepione dla statusu przypadków-kontroli. TP53 MAF z DNA zebranego przez UtL zostanie wykorzystany jako predyktor do różnicowania między pacjentami średniego ryzyka (AIM I) z HGSC i bez HGSC przez modelowanie regresji logistycznej. Wiek, historia palenia tytoniu, wcześniejsza ekspozycja na chemioterapię, rodność, wiek menopauzy, wiek pierwszej miesiączki, historia stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych, wywiad rodzinny w kierunku raka i status mutacji germinalnych będą uważane za potencjalne czynniki zakłócające. Przewidywanie modelu zostanie ocenione poprzez walidację krzyżową. Analogiczna analiza zostanie zastosowana do grupy pacjentów wysokiego ryzyka (AIM II), gdzie obecność i brak STIC definiuje zmienną wynikową. W obu przypadkach zostaną zasugerowane wartości odcięcia dla częstości zmutowanych alleli, a specyficzność i czułość zostaną oszacowane, w tym odpowiednie przedziały ufności.

Cel 1B: Poprawa wydajności diagnostycznej dzięki spersonalizowanej kalibracji na podstawie obciążenia mutacją tła.

Bezprecedensowa wrażliwość DS doprowadziła nas i innych do nowatorskiego odkrycia, że ​​mutacje podobne do raka gromadzą się z wiekiem na bardzo niskim poziomie w wielu ludzkich tkankach. W badaniu pilotażowym sponsor odkrył, że średnie obciążenie mutacją BB jest nieco wyższe w UtL niż w innych tkankach, potencjalnie z powodu udziału DNA z tkanki endometrium, która ulega znacznej replikacji przed menopauzą. Chociaż nie naruszyło to specyficzności badania pilotażowego, sponsor uznał, że BB może stanowić przeszkodę w przypadku niektórych bardzo wczesnych guzów, w przypadku których sygnał MAF jest niski, lub u kobiet w bardzo podeszłym wieku, u których tło jest wysokie. Sponsor spodziewa się, że filtracja przez płukanie i zbieranie fazy lutealnej u kobiet przed menopauzą zmniejszy sygnał BB, ale jako dodatkowy środek sponsor zbada, czy można jeszcze poprawić wydajność poprzez normalizację obciążenia mutacją tła danej osoby. Sponsor stawia hipotezę, że poziom mutacji TP53 w krążących leukocytach może służyć jako empirycznie mierzony osobisty kalibrator, który wychwytuje nie tylko znane czynniki zwiększające BB, takie jak wiek, ale także nieznane ekspozycje na mutageny lub inne czynniki występujące w życiu danej osoby. Chociaż DNA z leukocytów prawdopodobnie przyczynia się tylko w minimalnym stopniu do całkowitej puli mutacji BB w UtL, sponsor zakłada, że ​​mogą one służyć jako przysłowiowy „kanarek w kopalni węgla”, który będzie proporcjonalnie reprezentatywny dla mutacji BB w innych częściach ciała. Ładunku mutacji BB w popłuczynach nie można bezpośrednio zmierzyć w rzeczywistych warunkach, gdy mutacje spowodowane przez guz są nieznane. Wiarygodność tej koncepcji została wykazana przez nasze wstępne badanie mutacji TP53 w płynie otrzewnowym, które obejmowało podzbiór pasujących próbek krwi i wskazywało na silny związek między BB a wiekiem.

Metody: DNA ze składnika komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) – pobrane bezpośrednio przed operacją – z losowo wybranych 50 ze 100 przypadków HGSC i 50 ze 100 kontroli z Celu 1A zostanie wyekstrahowane i poddane TP53 DS przy ~10 000 razy molekularnej głębokość. Mutacje TP53 z PBMC zostaną odjęte od mutacji TP53 znalezionych w UtL.

Analiza statystyczna: Sponsor zbada związek między częstotliwościami mutacji TP53 w UtL i leukocytach i ustali, czy wyniki fałszywie ujemne w Celu 1A odpowiadają przypadkom zwiększonej BB w leukocytach. Ponadto sponsor przeanalizuje częstości mutacji TP53 w leukocytach jako predyktor stanu kontroli przypadku, ponownie stosując procedurę pomijania 10%. Ta innowacyjna metoda kalibracji zostanie porównana z prostymi wskaźnikami ROC uzyskanymi za pomocą modelu jednoczynnikowego wykorzystującego stałą frakcję mutacji, a także skorygowanego modelu wielowymiarowego opracowanego na podstawie innych cech pacjenta, takich jak wiek. Jako pytanie naukowe niezwiązane z obecnymi celami, sponsor chce zobaczyć, czy obciążenie mutacjami leukocytów TP53 będzie służyć jako niezależny predyktor wieku pacjenta, ogólnego stanu zdrowia lub historii narażenia na mutagen.

Cel 1C. Porównanie skuteczności diagnostycznej płukania macicy z DNA pobranym z wymazu cytologicznego.

Pierwsze doniesienie o wykorzystaniu NGS do wykrywania raka jajnika na podstawie płynnej biopsji przezpochwowej opierało się na pobraniu wymazu Pap i SafeSeqS jako technologii sekwencjonowania. Cytowana czułość wynosząca 41% stanowiła ważny dowód słuszności, ale także duże pole do ulepszeń. Sponsor ostatecznie wykazał wyższą dokładność DS w porównaniu z metodami podobnymi do SafeSeqS, a trwające badania w naszym laboratorium wskazują na ograniczoną czułość rozmazów Pap w porównaniu z UtL. Jednak bezpośrednie porównanie dwóch metod pobierania próbek u tych samych pacjentów pozostaje do przeprowadzenia. Formalne wykazanie stopnia wyższości UtL nad wymazami Pap pomoże w komercyjnym wejściu na rynek (sponsor zauważa, że ​​pokrewny NCI SBIR został przyznany PapGene Inc, firmie założonej przez autorów wyżej wymienionego badania). Oczekuje się wyższości UtL na podstawie faktu, że popłuczyny docierają do jajowodów i powierzchni jajników, podczas gdy rozmazy cytologiczne polegają na dotarciu rozsianych komórek nowotworowych do kanału szyjki macicy. Niemniej jednak, w przypadku gdyby TP53 DS na wymazach Pap nie osiągnął drastycznie gorszych wyników niż UtL, sponsor powinien dalej badać tę uzupełniającą metodę pobierania. Ponieważ wymazy cytologiczne są rutynowo wykonywane przez lekarzy podstawowej opieki zdrowotnej, możliwość ich wykorzystania może przyspieszyć przyjęcie na rynek. Jednak obecne dowody wskazują na prawdopodobną niższość rozmazów cytologicznych.

Metody: Sponsor przeprowadzi badanie TP53 DS jak powyżej, ale używając DNA z wymazów cytologicznych pobranych przed operacją na losowo wybranej, dopasowanej wiekowo podgrupie 25 przypadków raka i 25 kontroli z Celu 1A.

Analiza statystyczna: Dane dotyczące TP53 MAF z DNA zebrane za pomocą konwencjonalnych testów cytologicznych z podgrupy pacjentów o średnim ryzyku zostaną uznane za dodatkowy czynnik prognostyczny w modelach opracowanych w ramach celu 1A i 1B. Sponsor zbada, czy istnieje dodatkowa możliwość odróżnienia przypadków od kontroli można uzyskać, łącząc informacje z wymazów Pap i UtL.

CEL 2. POPULACJI WYSOKIEGO RYZYKA BADANIE PRZESIEWOWE W CELU WYKRYCIA RAKA JAJNIKA Cel ten będzie podobny do celu 1, ale skupi się na kobietach z grupy wysokiego ryzyka raka jajnika z powodu dziedzicznych mutacji raka piersi i jajnika (HBOC). Kobiety z HBOC zostaną zidentyfikowane na podstawie silnego wywiadu rodzinnego w kierunku raka piersi lub jajnika i stwierdzone, że są nosicielkami mutacji w genach podatności na raka, zwykle BRCA1 i BRCA2, które nadają ryzyko HGSC w ciągu całego życia na poziomie 35%, 46% i 13%, 23%, odpowiednio. Standardem postępowania jest zmniejszająca ryzyko wycięcie jajników jajnika (RRSO) we wczesnym wieku, zwykle po zakończeniu rodzenia. Chociaż to podejście zmniejsza śmiertelność, jest niedoskonałe: około 10% raków jajnika w tej populacji rozwija się przed 40 rokiem życia. W serii przypadków z Wiednia nowotwory obserwowano już w wieku 20 lat, czyli na długo przed wykonaniem profilaktycznej operacji. Tak więc, nawet przy standardowej opiece, kobiety z HBOC w wieku rozrodczym są znacznie bardziej narażone na raka jajnika w porównaniu z innymi kobietami, ich potrzeba skutecznego narzędzia przesiewowego jest jeszcze większa. Obecnie dotknięte chorobą kobiety muszą podjąć decyzję, czy zaakceptować zwiększone ryzyko wystąpienia wysoce śmiertelnego raka, czy też zapomnieć (lub przedwcześnie zakończyć) rodzenie dzieci. To potwornie trudna decyzja, przed którą stoją setki tysięcy kobiet w samych Stanach Zjednoczonych. W niektórych grupach etnicznych, zwłaszcza wśród Żydów aszkenazyjskich, ryzyko bycia nosicielem wynosi nawet 1 na 40. Jednak większość nosicieli BRCA, nawet ci, którzy nie mają operacji, nigdy nie rozwinie HGSC. Istnieje pilna potrzeba narzędzi diagnostycznych wczesnego wykrywania u kobiet z grupy wysokiego ryzyka HGCS w celu ratowania życia i zachowania możliwości wyboru płodności. Produktem tego celu będzie zestaw danych biomarkerów 115 pacjentów, który wykaże solidną komercyjnie wydajność takiego testu.

Cel 2A. Ocena wydajności testu TP53 DS na UtL do wykrywania HGSC u pacjentów wysokiego ryzyka.

Sponsor podejdzie do tego badania zgodnie z ogólnymi metodami Celu 1A. Jedną istotną różnicą jest to, że UtL będzie pobierany od kobiet z HBOC poddawanych RRSO, a nie od kobiet ze znanymi masami jajników. Po RRSO jajniki i jajowody przechodzą skrupulatny protokół cięcia znany jako SEE-FIM, aby dokładnie zbadać tkanki, zwłaszcza fimbrie, pod kątem STIC i utajonych nowotworów. Wśród tej populacji wysokiego ryzyka takie zmiany stwierdza się w około 5% resekcji. Grupa raka obejmie kobiety, u których podczas SEE-FIM wykryto STIC lub utajone guzy, grupa kontrolna obejmie kobiety bez zmian. Ten projekt badania jest innowacyjny, ponieważ koncentruje się nie tylko na kobietach z grupy wysokiego ryzyka, ale w szczególności na zdolności naszego testu do wykrywania bardzo wczesnych stadiów, potencjalnie nawet mikroskopijnych, raków, gdy pozostają one uleczalne chirurgicznie.

Metody: Próbki UtL od maksymalnie 115 kobiet z zespołami dziedzicznego raka jajnika wysokiego ryzyka zostaną przeanalizowane za pomocą DS: 15 z STIC lub utajonym rakiem (przypadki) i do 100 wolnych od raka (grupa kontrolna). Przypadek i kontrola zostaną dopasowane do wieku. UtL zostaną przeprowadzone bezpośrednio przed RRSO. Próbki chirurgiczne zostaną ocenione patologicznie za pomocą centralnie wystandaryzowanego protokołu SEE-FIM. Po RRSO jajniki i jajowody przechodzą skrupulatny protokół cięcia znany jako SEE-FIM, aby dokładnie zbadać tkanki, zwłaszcza fimbrie, pod kątem STIC i utajonych nowotworów. Sponsor spodziewa się zidentyfikować w tej kohorcie od 5 do 15 kobiet ze STIC lub utajonymi nowotworami, przy czym 100 kobiet w tym samym wieku nie będzie miało wykrytych zmian chorobowych. Mniejsza liczba przypadków raka niż grupa kontrolna odzwierciedla niski odsetek operacji z pozytywnym wynikiem zmian chorobowych i liczbę próbek, które projekt sponsora realistycznie jest w stanie osiągnąć. Chociaż optymalna byłaby większa liczba, takie próbki są bardzo ograniczone. Grupa z rakiem obejmie kobiety, u których wykryto STIC lub okultystyczny HGSC podczas SEE-FIM. Grupa kontrolna obejmie kobiety bez zmian. Analiza statystyczna: Będzie to zgodne z celem 1A.

Cel 2B. Kalibracja progu diagnostycznego u kobiet z grupy wysokiego ryzyka na podstawie obciążenia mutacją tła.

Ten cel cząstkowy będzie wykorzystywał ten sam protokół i metody statystyczne co cel 1B i zastosuje je do populacji wysokiego ryzyka w ramach celu 2.

Metody: Ocenione zostanie DNA leukocytów ze wszystkich dostępnych przypadków raka i losowo wybranej podgrupy 30 kobiet z grupy kontrolnej. Powszechnie wiadomo, że ryzyko nowotworów złośliwych u kobiet z HBOC jest podwyższone w porównaniu z innymi z powodu defektów w naprawie DNA, które zwiększają prawdopodobieństwo powstania mutacji onkogennych. W związku z tym sponsor przewiduje, że ładunek mutacji tła niezwiązanych z rakiem, mierzony w UtL, jak również we krwi obwodowej, może być również proporcjonalnie podwyższony. Dostosowanie do wysokiego ładunku mutacji tła mierzonego we krwi może być szczególnie ważne dla zwiększenia swoistości w tej grupie.

Analiza statystyczna: Będzie to zgodne z celem 1B.

CEL III Zdefiniowanie sygnatury metylacji do wykrywania HGSC w UtL. W ciągu ostatnich 15 lat wykazano przydatność analizy metylacji DNA w wykrywaniu zmian epigenetycznych, specyficznych dla nowotworu, zwłaszcza w diagnostyce nowotworów. Badania metylacji DNA w raku jajnika (OC) koncentrowały się na wykrywaniu fragmentów DNA wydalanych przez komórki OC do krwioobiegu (tj. wolne od komórek DNA - cfDNA) sugerują, że wzorce metylacji DNA w cfDNA mogą potencjalnie wykryć część OC nawet na dwa lata przed diagnozą. Badanie to wyraźnie pokazuje również ograniczenia tego podejścia, ponieważ można było wykryć tylko 50% wszystkich pacjentek, u których ostatecznie rozwinął się surowiczy rak jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSC) w ciągu dwóch lat. Podstawowy problem polega na tym, że ze względu na niskie stężenie cfDNA we krwi, konieczne jest wykrycie bardzo słabego sygnału. W celu potencjalnego zwiększenia czułości wykrywania HGSC sponsor we współpracy z prof. Andreasem Weinhäuselem z Austriackiego Instytutu Technologii (AIT), Competence Unit Molecular Diagnostics przeprowadzi badanie sprawdzające słuszność koncepcji na podgrupie pacjentów włączonych do ten projekt. Prof. Andreas Weinhäusel zidentyfikował 96 markerów metylacji istotnych dla HGSC. Tylko bardzo mała ilość DNA jest wymagana do metylacji DNA. Dlatego wskazane jest wykorzystanie już dostępnego DNA z popłuczyn i odpowiedniej tkanki nowotworowej, które zostało wyekstrahowane w trakcie tego badania, w celu dalszego rozwoju specyficzności i czułości procedury testowej. Produktem AIM3 będzie zestaw danych markerów metylacji 140 pacjentów, który wykazuje wysoką czułość takiego testu.

Metody: Genomowy DNA z UtL i odpowiadająca mu tkanka nowotworowa od 30 pacjentów z HGSC i 10 STIC/rakami utajonymi zostanie wzbogacony w metylowany DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych wrażliwych na metylację. To DNA zostanie przeanalizowane przez wykonanie wysokoprzepustowego put-qPCR, w którym równolegle analizowane będzie 5 x 96 markerów x 96 DNA. Markery zawierające najwięcej informacji zostaną połączone w sygnaturę metylacji. Aby udowodnić specyficzność sygnatury DNA z UtL z 60 kontroli, zostanie przeanalizowanych (30 przypadków średniego ryzyka i 30 przypadków wysokiego ryzyka). Ocena wzorca metylacji DNA zostanie przeprowadzona na popłuczynach przed resekcją oraz na maksymalnie 10 zmianach STIC/ukrytych rakach. Kiedy lokalne wyniki patologii identyfikują STIC lub utajone komórki nowotworowe (tkanka FFPE), przeprowadzana jest mikrodysekcja laserowa i izolacja DNA. Następnie zostanie przeprowadzone standardowe sekwencjonowanie NGS TP53, jak opisano w AIM 1 i AIM 2. W tym pilotażowym badaniu cząstkowym do pozostałego materiału DNA zostanie zastosowany wysokowydajny test qPCR w celu oceny stanu metylacji.

Analiza statystyczna: Mając na celu ocenę możliwości zdefiniowania sygnatury metylacji DNA dla prostych testów PCR, wartości dCT-PCR z wysokoprzepustowej analizy MSREqPCR z 96-pleksami zostaną przeanalizowane przez działy bioinformatyki i biostatystyki w celu przeprowadzenia 1) porównania klas między odpowiednimi klinicznymi podtypy i klasy do definiowania genów znacznie różniących się metylacją; 2) wielowymiarowa analiza predykcji klas przy użyciu różnych podejść do selekcji cech w oparciu o wartości p dla pojedynczego znacznika. Różne algorytmy klasyfikacji (np. k-najbliższy sąsiad, maszyny wektorów nośnych, analizy dyskryminacji liniowej itp.) zostaną zastosowane przy użyciu 10-krotnej walidacji krzyżowej i/lub walidacji krzyżowej pomijania jednego z nich w celu wybrania najlepszych kandydujących markerów metylacji - i algorytmów; ponadto górne wartości AUC pojedynczego kandydującego markera metylacji zostaną zdefiniowane w analizie ROC i uwzględnione przy wyborze markera.

Podzbiór 48 kandydujących markerów zostanie wybrany do potwierdzenia w oddzielnym zestawie próbek. Uzyskane z nich dane dotyczące metylacji będą analizowane przy użyciu porównania klas i analizy przewidywania klas w podobny sposób, jak pierwszy zestaw danych uzyskany z analizy 480plexed. Zostaną zdefiniowane najlepiej działające pojedyncze markery i kombinacje markerów z analizy wielowymiarowej. Wyniki klasyfikacji i dane dotyczące metylacji zostaną porównane z wynikami testu mutacji p53 w celu oceny potencjału klasyfikacji diagnostycznej opartej na metylacji, jako jedynej iw połączeniu z analizą mutacji p53. Zostanie to przeprowadzone przy użyciu różnych metod przewidywania klas, integrujących zarówno dane p53, jak i dane dotyczące metylacji w modelach wielowymiarowych.