Vroege detectie van hooggradige eierstokkanker met behulp van EHUD-onderzoek naar lavage van de baarmoeder en duplexsequencing (EHUD)

AANPAK FASE I De Universiteit van Washington heeft diagnostisch bewijs van het principe aangetoond; verdere optimalisatie en validatie is echter nodig voor implementatie op industriële schaal. In Fase I zal de UtL-filtratiemethode worden geoptimaliseerd (Doel 1), de analytische prestaties op de commerciële workflow worden gevalideerd (Doel 2) en wordt een mijlpaal bereikt voor het verzamelen van monsters (Doel 3). Doel 1. Bepaal de bruikbaarheid van uteriene lavagefiltratie om de verrijking van tumor-afkomstig DNA te maximaliseren. Voorlopige tests met twee monsters gaven aan dat filtratie van UtL's om clusters van endometriumcellen te verwijderen, de gevoeligheid voor tumormutaties meerdere malen zou kunnen verhogen. Deze dataset zal worden uitgebreid door het filtratie-effect te analyseren in 10 UtL's van patiënten met HGSC met bekende TP53-mutaties. Elke UtL wordt in tweeën gedeeld: de eerste helft wordt gefilterd en de tweede blijft ongefilterd. DNA zal worden geëxtraheerd uit de gefilterde, filtraat- en ongefilterde fracties en geanalyseerd door TP53 DS (in totaal 30 monsters). Voor elke UtL wordt de DNA-opbrengst in elk van de fracties en de MAF van de tumormutatie vergeleken. Er wordt verwacht dat de gefilterde fractie minder DNA zal bevatten dan de ongefilterde fractie, maar de tumormutatie zal met een hogere frequentie aanwezig zijn. Als de gevoeligheid wordt verbeterd (d.w.z. er wordt meer gewonnen door verrijking dan er verloren gaat door reductie van minder beschikbaar DNA), zal filtratie worden gebruikt op alle toekomstige verzamelde monsters. Doel 2. Validatie van geoptimaliseerde assay: nauwkeurigheid, precisie, detectielimiet en reproduceerbaarheid. TwinStrand heeft een gestroomlijnde DS-workflow ontwikkeld met behulp van verbeterde adapters, ligatiechemie en een op platen gebaseerd formaat met 96 putjes met hoge doorvoer, geschikt voor vloeistofbehandelingsrobots en compatibel met CLIA-laboratoriumstandaarden.

TwinStrand heeft ook een geoptimaliseerde cloudgebaseerde analysepijplijn ontwikkeld die geautomatiseerde parallelle verwerking van meerdere monsters ondersteunt. Het geoptimaliseerde proces voor de detectie van TP53-mutaties in UtL-stalen zal gevalideerd worden. Om nauwkeurigheid, technische precisie en ondergrens van detectie te beoordelen, zullen DNA-monsters van twee individuen die verschillen in genotype op> 5 SNP-locaties in of nabij TP53 worden gemengd, in verhoudingen van 1: 100 1: 5.000, twee UtL. De mengsels zullen worden gesequenced op ~10.000x moleculaire diepte in twee onafhankelijke experimenten. SNP-allelfractie (AF) zal worden vergeleken bij verschillende verdunningen om de nauwkeurigheid (verwachte AF vs. waargenomen AF), precisie (AF-variatie tussen replicaten) en de laagst haalbare detectielimiet te bepalen. Om de reproduceerbaarheid van de assay te testen voor het beoogde klinische gebruik, zal de sequentiëring worden herhaald op de 30 monsters die worden gebruikt Aim 1, die een breed scala aan tumor-MAF's zullen omvatten. De sponsor berekent de variatiecoëfficiënt tussen herhalingen. Op basis van pilotstudies verwacht de opdrachtgever een uitstekende reproduceerbaarheid (CV<5%). Doel 3. Monsterverzameling. Het verzamelen van monsters die in fase II worden voorgesteld, zal worden gestart met de juiste goedkeuring van de IRB/ethische commissie bij elke deelnemende instelling.

Na verzameling worden de monsters verzonden naar het Instituut voor Kankeronderzoek van de Medische Universiteit van Wenen, die UtL-filtratie en DNA-extractie zal uitvoeren.

Gepaard DNA van Pap-uitstrijkjes en perifere leukocyten zal ook worden geëxtraheerd. Geïsoleerde DNA's krijgen een de-identificatienummer en worden verzonden naar TwinStrand voor Duplex Sequencing.

Mijlpalen van fase I:

1. Bevestig het nut van UtL-filtratie op verrijking van tumormutaties.
2. Kwantificeer de nauwkeurigheid, precisie, ondergrens van detectie en reproduceerbaarheid van gestroomlijnde assays op UtL's.
3. Begin met het verzamelen van monsters voor fase II.

Fase I-producten:

1. DS workflow klaar voor toepassing op UtL DNA op commerciële schaal in Fase II en Fase III.
2. Monsterbank voor fase II

AANPAK FASE II Fase II zal het gebruik van TP53 DS op UtL's valideren voor de vroege detectie van eierstokkanker in patiëntencohorten met uitgebreide case-control die zowel gemiddelde als hoge risicopopulaties omvatten. Vooraf gedefinieerde parameters die de gevoeligheid en specificiteit van de TP53-mutatiefrequentie kunnen beïnvloeden, zullen worden onderzocht en statistisch worden gemodelleerd. De klinische sensitiviteit en specificiteit zullen worden gemaximaliseerd door gepersonaliseerde statistische modellen voor de diagnostische drempel te bouwen met behulp van multivariate klinische kenmerken, evenals de unieke achtergrondmutatiebelasting van elk individu op basis van leukocytsequencing. Bij een subgroep van patiënten zal de superieure prestatie van UtL ten opzichte van uitstrijkjes worden bevestigd. Daarnaast zal een proof of concept-studie worden uitgevoerd in een subgroep van geïncludeerde patiënten om een ​​set van 96 methylatiemarkers te bestuderen die relevant zijn voor HGSC in UtL's en bijbehorend tumorweefsel/STIC's.

DOEL 1. ALGEMENE BEVOLKING Eierstokkanker SCREENING Dit doel zal een biomarker ontwikkelen voor HGSC-detectie in een gemiddelde risicopopulatie. De sponsor zal een case-control-onderzoek uitvoeren dat TP53 DS-mutatiegegevens integreert met klinische pathologische informatie om vrouwen met HGSC met maximale gevoeligheid en specificiteit te identificeren. Meer dan 98% van de HGSC's dragen mutaties in TP53, wat betekent dat ultradiepe DS kosteneffectief kan worden gericht op slechts een kleine genomische regio. Het product van dit doel zal een dataset voor biomarkers van 200 patiënten zijn die de kosteneffectieve, commercieel robuuste prestatie van deze uiterst noodzakelijke diagnostiek van eierstokkanker aantoont.

Doel 1A: Het beoordelen van de testprestaties van TP53 DS op UtL's voor HGSC-detectie bij patiënten met een gemiddeld risico.

Methoden: UtL-monsters van 200 proefpersonen uit de gemiddelde risicopopulatie zullen worden geanalyseerd via DS: 100 proefpersonen met HGSC (gevallen) en 100 proefpersonen met laesies die uiteindelijk goedaardig bleken te zijn na resectie, d.w.z. zonder kanker (controles). Bij alle patiënten wordt UtL afgenomen voorafgaand aan een chirurgische ingreep voor een ovariumgezwel. Lavage wordt uitgevoerd tijdens de luteale fase van de menstruele cyclus indien premenopauzaal. Chirurgische monsters worden pathologisch beoordeeld en een patiënt wordt geteld als HGSC-positief of als controle, afhankelijk van de histologische resultaten. Voor kankerpatiënten zal de primaire tumor via conventionele methoden worden gesequenced door de Medische Universiteit van Wenen voor een panel van genen waaronder TP53, BRCA1 en BRCA2. Voor alle geanonimiseerde patiëntmonsters omvat de verzamelde klinische informatie: leeftijd, rookgeschiedenis, eerdere blootstelling aan chemotherapie, pariteit, leeftijd van menopauze, leeftijd van menarche, geschiedenis van gebruik van orale anticonceptiva, familiegeschiedenis van kanker en zeven- genmutatiestatus van de primaire tumor. Gevallen en controles zullen op leeftijd worden afgestemd en er zal een zo breed mogelijk leeftijdsbereik worden opgenomen om het effect van leeftijd op sensitiviteit en specificiteit te beoordelen.

Statistische analyse: er wordt een gedetailleerd mutatieprofiel voor elk monster gegenereerd op basis van de uitvoerbestanden voor duplexsequencing, waaronder: mutant allel frequency (MAF) voor alle gemuteerde posities, mutatiespectrum, voorspelde pathogeniteit voor eiwitfunctie, relatie met bekende hotspots en algehele mutatiebelasting (aantal mutante nucleotiden gedeeld door het totale aantal nucleotiden waarvan de sequentie is bepaald). Hierna worden monsters gedeblindeerd voor de status Case-Controls. TP53 MAF uit DNA verzameld door UtLs zal worden gebruikt als voorspeller voor het differentiëren tussen patiënten met gemiddeld risico (AIM I) met en zonder HGSC door middel van logistische regressiemodellering. Leeftijd, voorgeschiedenis van roken, eerdere blootstelling aan chemotherapie, pariteit, leeftijd van de menopauze, leeftijd van de menarche, voorgeschiedenis van gebruik van orale anticonceptiva, familiegeschiedenis van kanker en de status van kiembaanmutaties zullen als mogelijke confounders worden beschouwd. Modelvoorspelling zal worden beoordeeld door middel van kruisvalidatie. Een analoge analyse zal worden toegepast op de groep hoogrisicopatiënten (AIM II) waar aan- en afwezigheid van STIC de uitkomstvariabele bepaalt. In beide gevallen zullen afkapwaarden voor de frequentie van het gemuteerde allel worden voorgesteld en de specificiteit en gevoeligheid worden geschat, inclusief de juiste betrouwbaarheidsintervallen.

Doel 1B: Verbetering van diagnostische prestaties met gepersonaliseerde kalibratie door achtergrondmutatiebelasting.

De ongekende gevoeligheid van het syndroom van Down leidde ons en anderen tot de nieuwe ontdekking dat kankerachtige mutaties zich met de leeftijd op zeer lage niveaus ophopen in meerdere menselijke weefsels. In een pilootstudie ontdekte de sponsor dat de gemiddelde BB-mutatiebelasting iets hoger is in UtL's dan in andere weefsels, mogelijk vanwege de DNA-bijdrage van endometriumweefsel, dat uitgebreid wordt gerepliceerd voorafgaand aan de menopauze. Hoewel dit geen afbreuk deed aan de specificiteit van de pilotstudie, erkent de sponsor dat BB een obstakel zou kunnen vormen bij enkele zeer vroege tumoren waarbij het MAF-signaal laag is, of bij zeer oudere vrouwen met een hoge achtergrond. De sponsor verwacht dat lavagefiltratie en luteale fase-verzameling bij premenopauzale vrouwen het BB-signaal zullen verminderen, maar als extra maatregel zal de sponsor onderzoeken of de prestaties verder kunnen worden verbeterd door te normaliseren voor de achtergrondmutatiebelasting van een individu. De sponsor veronderstelt dat het niveau van TP53-mutaties in circulerende leukocyten kan dienen als een empirisch gemeten persoonlijke kalibrator die niet alleen bekende factoren vastlegt die BB verhogen, zoals leeftijd, maar ook onbekende mutagene blootstellingen of andere factoren die optreden tijdens het leven van een persoon. Hoewel DNA van leukocyten waarschijnlijk slechts een minimale bijdrage levert aan de totale pool van BB-mutaties in UtL's, stelt de sponsor dat ze kunnen dienen als een spreekwoordelijke "kanarie in een kolenmijn" die proportioneel representatief zal zijn voor BB-mutaties elders in het lichaam. De BB-mutatiebelasting in een lavage zelf kan niet direct worden gemeten in een echte wereld wanneer de mutatie(s) die door een tumor worden bijgedragen, onbekend zijn. De plausibiliteit van dit concept werd aangetoond door onze eerste studie van TP53-mutaties in peritoneale vloeistof, die een subset van overeenkomende bloedmonsters omvatte en duidde op een sterke associatie tussen BB en leeftijd.

Methoden: DNA van de component perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) - verzameld onmiddellijk voorafgaand aan een operatie - van willekeurig gekozen 50 van 100 HGSC-gevallen en 50 van 100 controles van Aim 1A zal worden geëxtraheerd en onderworpen aan TP53 DS op ~ 10.000x moleculaire waarde. diepte. TP53-mutaties van PBMC's zullen worden afgetrokken van TP53-mutaties gevonden in de UtL.

Statistische analyse: de sponsor onderzoekt de associatie tussen TP53-mutatiefrequenties in UtL en leukocyten en bepaalt of fout-negatieven in doel 1A overeenkomen met gevallen met verhoogde BB in leukocyten. Daarnaast zal de sponsor de TP53-mutatiefrequenties in leukocyten analyseren als een voorspeller van de case-control-status, opnieuw met behulp van de weglaten-10%-procedure. Deze innovatieve kalibratiemethode zal worden vergeleken met de eenvoudige ROC-metrieken die worden bereikt met het univariate model met behulp van een vaste mutatiefractie, evenals met het aangepaste multivariate model dat is ontwikkeld op basis van andere patiëntkenmerken zoals leeftijd. Als een wetenschappelijke vraag die geen verband houdt met de huidige doelstellingen, wil de sponsor graag zien of de mutatiebelasting van leukocyten TP53 zal dienen als een onafhankelijke voorspeller van de leeftijd van de patiënt, de algehele gezondheid of de geschiedenis van mutagene blootstellingen.

Doel 1C. Vergelijking van de diagnostische prestatie van baarmoederspoeling vs. uit een uitstrijkje verkregen DNA.

Het eerste rapport over het gebruik van NGS voor de detectie van eierstokkanker uit een transvaginale vloeistofbiopsie was gebaseerd op het verzamelen van uitstrijkjes en SafeSeqS als sequencingtechnologie. De genoemde sensitiviteit van 41% leverde een belangrijk proof of principle op, maar ook voldoende ruimte voor verbetering. De sponsor heeft de superieure nauwkeurigheid van DS ten opzichte van SafeSeqS-achtige methoden definitief aangetoond en lopende onderzoeken in ons laboratorium wijzen op een beperkte gevoeligheid van Pap-uitstrijkjes in vergelijking met UtL. Een directe vergelijking van de twee verzamelmethoden bij dezelfde patiënten moet echter nog worden uitgevoerd. Het formeel aantonen van de mate van superioriteit van UtL ten opzichte van Pap-uitstrijkjes zal helpen bij het betreden van de commerciële markt (de sponsor merkt op dat een gerelateerde NCI SBIR is toegekend aan PapGene Inc, een bedrijf dat is opgericht door de auteurs van de bovengenoemde studie). De superioriteit van UtL wordt verwacht op basis van het feit dat de lavages de eileiders en eierstokoppervlakken bereiken, terwijl Pap-uitstrijkjes afhankelijk zijn van uitgezaaide kankercellen die het cervicale kanaal bereiken. Niettemin, in het geval dat TP53 DS op Pap-uitstrijkjes niet drastisch slechter presteert dan UtL, zou de sponsor deze aanvullende verzamelmethode verder onderzoeken. Omdat Pap-uitstrijkjes routinematig worden uitgevoerd door eerstelijnszorgverleners, kan de mogelijkheid om deze te gebruiken de acceptatie op de markt helpen versnellen. Het huidige bewijs wijst echter op de waarschijnlijke minderwaardigheid van uitstrijkjes.

Methoden: De sponsor zal TP53 DS uitvoeren zoals hierboven beschreven, maar met behulp van DNA van Pap-uitstrijkjes die voorafgaand aan de operatie zijn verzameld van een willekeurig geselecteerde, op leeftijd afgestemde subgroep van 25 kankergevallen en 25 controles van Aim 1A.

Statistische analyse: gegevens over TP53 MAF uit DNA verzameld door conventionele uitstrijkjes van een deelmonster van patiënten met een gemiddeld risico zullen worden beschouwd als aanvullende voorspeller in modellen die zijn ontwikkeld binnen doelstelling 1A en 1B. De sponsor zal onderzoeken of er een aanvullende mogelijkheid is om gevallen van controles te onderscheiden kan worden verkregen door informatie uit Pap-uitstrijkjes en UtL's te combineren.

DOEL 2. SCREENING VAN EIERSTOFKANKER MET HOGE RISICO'S Dit doel is vergelijkbaar met dat van doel 1, maar richt zich op vrouwen met een hoog risico op eierstokkanker als gevolg van erfelijke borst- en eierstokkanker (HBOC)-mutaties. HBOC-vrouwen zijn geïdentificeerd door een sterke familiegeschiedenis van borst- of eierstokkanker en blijken mutaties te dragen in genen voor kankergevoeligheid, meestal BRCA1 en BRCA2, die een levenslang HGSC-risico van 35%, 46% en 13%, 23% opleveren. respectievelijk. Standaardzorg is risicoverlagende salpingo-ovariëctomie (RRSO) op jonge leeftijd, meestal na het voltooien van de zwangerschap. Hoewel deze aanpak de mortaliteit vermindert, is ze onvolmaakt: ongeveer 10% van de eierstokkankers in deze populatie ontwikkelt zich vóór de leeftijd van 40 jaar. In de Weense casusreeks werden kankers gezien op een jonge leeftijd van 20 jaar, wat lang is voordat een profylactische operatie normaal gesproken zou zijn ondernomen. Dus, zelfs met standaardzorg, lopen HBOC-vrouwen in hun reproductieve jaren een significant verhoogd risico op eierstokkanker in vergelijking met andere vrouwen. Hun behoefte aan een effectief screeningsinstrument is zelfs nog groter. Op dit moment moeten getroffen vrouwen de beslissing nemen om het verhoogde risico op een zeer dodelijke vorm van kanker te accepteren of ervoor te kiezen om het krijgen van kinderen te vergeten (of voortijdig te beëindigen). Dit is een tergend uitdagende beslissing waar alleen al in de VS honderdduizenden vrouwen mee te maken hebben. In bepaalde etnische groepen, met name Asjkenazische joden, is het risico om drager te zijn zo hoog als 1 op 40. Toch zal de meerderheid van de BRCA-dragers, zelfs degenen die geen operatie ondergaan, nooit HGSC ontwikkelen. Er is dringend behoefte aan diagnostische hulpmiddelen voor vroege detectie bij vrouwen met een hoog risico op HGCS om levens te redden en de keuze voor vruchtbaarheid te behouden. Het product van dit doel zal een gegevensset voor biomarkers van 115 patiënten zijn die de commercieel robuuste prestaties van een dergelijke test aantoont.

Doel 2A. Om de testprestaties van TP53 DS op UtL's voor HGSC-detectie bij patiënten met een hoog risico te beoordelen.

De sponsor zal dit onderzoek benaderen volgens de algemene methoden van doel 1A. Een significant verschil is dat UtL wordt verzameld bij HBOC-vrouwen die RRSO ondergaan, in plaats van bij vrouwen met bekende ovariële massa's. Na RRSO ondergaan de eierstokken en eileiders een nauwgezet snijprotocol dat bekend staat als SEE-FIM om de weefsels, met name de fimbriae, zorgvuldig te onderzoeken op STIC's en occulte kankers. Onder deze populatie met een hoog risico worden dergelijke laesies gevonden in ongeveer 5% van de resecties. De kankergroep omvat vrouwen bij wie STIC's of occulte tumoren werden gevonden tijdens SEE-FIM, de controlegroep omvat vrouwen zonder laesies. Deze onderzoeksopzet is innovatief omdat het zich niet alleen richt op vrouwen met een hoog risico, maar specifiek op het vermogen van onze test om kanker in een zeer vroeg stadium, mogelijk zelfs microscopisch, op te sporen wanneer ze chirurgisch te genezen blijven.

Methoden: UtL-monsters van maximaal 115 vrouwen met erfelijke hoog-risico eierstokkankersyndromen zullen worden geanalyseerd via DS: 15 met STIC's of occulte kanker (gevallen) en tot 100 kankervrij (controles). Zaak en controle worden gematcht op leeftijd. UtL's worden direct voorafgaand aan RRSO uitgevoerd. Chirurgische monsters zullen pathologisch worden beoordeeld door middel van een centraal gestandaardiseerd SEE-FIM-protocol. Na RRSO ondergaan de eierstokken en eileiders een nauwgezet snijprotocol dat bekend staat als SEE-FIM om de weefsels, met name de fimbriae, zorgvuldig te onderzoeken op STIC's en occulte kankers. De sponsor verwacht in dit cohort 5 tot 15 vrouwen met STIC of occulte kankers te hebben geïdentificeerd, 100 vrouwen van dezelfde leeftijd zullen geen gedetecteerde laesies hebben. Het kleinere aantal kankergevallen dan de controles weerspiegelt het lage percentage laesie-positieve operaties en het aantal steekproeven dat het sponsorproject realistisch gezien kan bereiken. Hoewel een groter aantal optimaal zou zijn, zijn dergelijke steekproeven uiterst beperkt. De kankergroep zal vrouwen omvatten waar STIC's of occulte HGSC werden gevonden tijdens SEE-FIM. De controlegroep zal vrouwen zonder laesies omvatten. Statistische analyse: Dit zal zijn volgens doel 1A.

Doel 2B. Diagnostische drempelkalibratie bij vrouwen met een hoog risico door achtergrondmutatiebelasting.

Dit subdoel gebruikt hetzelfde protocol en dezelfde statistische methoden als doel 1B en past deze toe op de hoogrisicopopulatie van doel 2.

Methoden: Leukocyten-DNA van alle beschikbare kankergevallen en een willekeurig gekozen deelgroep van 30 vrouwen van de controlegroep zal worden geëvalueerd. Het is algemeen bekend dat het risico op maligniteit bij HBOC-vrouwen hoger is dan bij andere vrouwen vanwege defecten in DNA-herstel die de kans op oncogene mutaties vergroten. Als zodanig verwacht de sponsor dat de niet van kanker afkomstige achtergrondmutatiebelasting, gemeten in zowel UtL's als in perifeer bloed, ook proportioneel verhoogd kan zijn. Aanpassing voor de hoge achtergrondmutatiebelasting gemeten in bloed kan met name belangrijk zijn om de specificiteit in deze groep te verhogen.

Statistische analyse: dit is volgens doel 1B.

DOEL III Het definiëren van een methyleringshandtekening voor HGSC-detectie in UtL's. De afgelopen 15 jaar is de waarde van DNA-methylatie-analyse voor de detectie van epigenetische, tumorspecifieke veranderingen aangetoond, met name in de kankerdiagnostiek. Studies naar DNA-methylatie bij eierstokkanker (OC) waren gericht op het detecteren van DNA-fragmenten die door OC-cellen in de bloedbaan terechtkomen (d.w.z. celvrij DNA - cfDNA) suggereren dat DNA-methylatiepatronen in cfDNA het potentieel hebben om een ​​deel van de OC's tot twee jaar vóór de diagnose te detecteren. Deze studie toont ook duidelijk de beperking van deze benadering aan, omdat slechts 50% van alle patiënten die uiteindelijk binnen twee jaar hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSC) ontwikkelden, kon worden opgespoord. Het onderliggende probleem is dat door de lage concentratie cfDNA in de bloedbaan een zeer zwak signaal gedetecteerd moet worden. Met als doel de gevoeligheid van HGSC-detectie mogelijk te vergroten, zal de sponsor in samenwerking met prof. Andreas Weinhäusel, Oostenrijks Instituut voor Technologie (AIT), Competence Unit Molecular Diagnostics, een proof of concept-onderzoek uitvoeren in een subgroep van patiënten die zijn opgenomen in dit project. Prof. Andreas Weinhäusel identificeerde 96 methyleringsmarkers die relevant zijn voor HGSC. Er is slechts een zeer kleine hoeveelheid DNA nodig voor DNA-methylatie. Het is daarom raadzaam om het reeds beschikbare DNA uit de lavages en het bijbehorende tumorweefsel, dat in de loop van dit onderzoek is gewonnen, te gebruiken voor de verdere ontwikkeling van de specificiteit en gevoeligheid van de testprocedure. Het product van AIM3 zal een gegevensset voor methylatiemarkers van 140 patiënten zijn die de zeer gevoelige prestaties van een dergelijke test aantoont.

Methoden: Genomisch DNA van UtL's en overeenkomstig tumorweefsel van 30 HGSC-patiënten en 10 STIC's/occulte kankers zullen worden verrijkt voor gemethyleerd DNA met behulp van methylatiegevoelige restrictie-enzymen. Dit DNA zal worden geanalyseerd door een highthrough put-qPCR uit te voeren waarin parallel 5 x 96 marker x 96 DNA zal worden geanalyseerd. De meest informatieve markers zullen worden gecombineerd tot een methyleringssignatuur. Om de specificiteit van het kenmerkende DNA van UtL's van 60 controles te bewijzen, zal het worden geanalyseerd (30 gemiddeld risico en 30 hoog risico gevallen). Beoordeling van het DNA-methylatiepatroon zal worden uitgevoerd op de pre-resectiespoelingen en op maximaal 10 STIC-laesies/occulte kankers. Wanneer lokale pathologieresultaten STIC's of occulte kankercellen (FFPE-weefsel) identificeren, zullen lasermicrodissectie en DNA-isolatie worden uitgevoerd. Vervolgens zal standaard NGS TP53-sequencing worden uitgevoerd zoals beschreven in AIM 1 en AIM 2. In deze pilot-substudie zal high-through put-qPCR worden toegepast op het resterende DNA-materiaal voor beoordeling van de methylatiestatus.

Statistische analyse: met als doel het potentieel te evalueren voor het definiëren van een DNA-methylatiesignatuur voor eenvoudige PCR-testen, zullen dCT-PCR-waarden van 96-plexed high-throughput MSREqPCR-analyse worden geanalyseerd door bioinformatica en biostatistiek om 1) klassenvergelijking uit te voeren tussen de relevante klinische subtypen en klassen voor het definiëren van significant differentieel gemethyleerde genen; 2) multivariate klassenvoorspellingsanalyse met behulp van verschillende kenmerkselectiebenaderingen op basis van p-waarden met één merker. Verschillende classificatie-algoritmen (bijv. k-naaste buur, ondersteunende vectormachines, lineaire discriminatie-analyses etc.) zullen worden toegepast, gebruikmakend van 10-voudige kruisvalidatie en/of weglaten-één-uit kruisvalidatie voor het selecteren van de beste kandidaat-methylatiemerkers - en algoritmen; bovendien zullen de top-AUC-waarden van afzonderlijke kandidaat-methyleringsmarkers worden gedefinieerd in ROC-analyse en worden overwogen voor markerselectie.

Een subset van 48 kandidaat-markers zal worden geselecteerd voor bevestiging in een aparte sample set. De daaruit afgeleide methylatiegegevens zullen worden geanalyseerd met behulp van klassevergelijking en klassevoorspellingsanalyse op een vergelijkbare manier als de eerste reeks gegevens die zijn afgeleid van 480-plexanalyse. De best presterende enkelvoudige merkers en combinaties van merkers uit multivariate analyse zullen worden gedefinieerd. Classificatieresultaten en methylatiegegevens zullen worden vergeleken met p53-mutatietestresultaten om het potentieel van op methylatie gebaseerde diagnostische classificatie te evalueren, als enige en in combinatie met p53-mutatieanalyse. Dit zal worden uitgevoerd met behulp van verschillende klassenvoorspellingsbenaderingen waarbij zowel p53- als methyleringsgegevens worden geïntegreerd in multivariate modellen.