Magas fokú petefészekrák korai felismerése méhmosó EHUD vizsgálat és duplex szekvenálás segítségével (EHUD)

MEGKÖZELÍTÉS I. FÁZIS A Washingtoni Egyetem bebizonyította az elv diagnosztikus bizonyítékát; azonban további optimalizálás és érvényesítés szükséges az ipari méretű telepítéshez. Az I. fázisban az UtL szűrési módszert optimalizálják (1. cél), a kereskedelmi munkafolyamat analitikai teljesítményét validálják (2. cél), és teljesítik a mintagyűjtési mérföldkövet (3. cél). Cél 1. Határozza meg a méhmosó szűrés használhatóságát a tumorból származó DNS dúsításának maximalizálására. A két mintával végzett előzetes tesztelés azt mutatta, hogy az UtL-ek szűrése az endometrium sejtcsoportok eltávolítására többszörösére növelheti a tumormutációk iránti érzékenységet. Ezt az adatkészletet kibővítjük a szűrési hatás 10 UtL-ben történő elemzésével olyan HGSC-ben szenvedő betegekből, akiknek ismert TP53 mutációi vannak. Minden egyes UtL fele lesz: az első fele szűrve lesz, a második pedig szűretlen marad. A DNS-t kivonják a szűrt, a szűrletből és a szűretlen frakciókból, és TP53 DS-sel elemzik (összesen 30 minta). Minden egyes UtL esetében összehasonlítjuk az egyes frakciók DNS-hozamát és a tumormutáció MAF-értékét. Várhatóan a szűrt frakció kevesebb DNS-t tartalmaz, mint a szűretlen frakció, de a tumormutáció nagyobb gyakorisággal lesz jelen. Ha az érzékenység javul (azaz többet nyerünk a dúsítással, mint amennyit veszítünk a kevesebb elérhető DNS-ből való redukcióval), szűrést alkalmazunk minden jövőben begyűjtött mintán. 2. cél. Az optimalizált vizsgálat validálása: pontosság, precizitás, kimutatási határ és reprodukálhatóság. A TwinStrand egy áramvonalas DS-munkafolyamatot fejlesztett ki továbbfejlesztett adapterek, ligálási kémia és nagy áteresztőképességű, 96 lyukú lemezalapú formátum felhasználásával, amely alkalmas folyadékkezelő robotokhoz, és kompatibilis a CLIA laboratóriumi szabványaival.

A TwinStrand egy optimalizált felhőalapú elemzési folyamatot is kifejlesztett, amely támogatja több minta automatizált párhuzamos feldolgozását. A TP53 mutációk UtL-mintákban történő kimutatására szolgáló optimalizált folyamat validálásra kerül. A pontosság, a technikai precizitás és a kimutatás alsó határának értékelése érdekében két olyan egyed DNS-mintáját, amelyek genotípusa különbözik a TP53-ban vagy annak közelében található >5 SNP-helyen, összekeverik 1:100 és 1:5000 közötti arányban, két UtL-ben. A keverékeket körülbelül 10 000-szeres molekula mélységben szekvenálják két független kísérletben. Az SNP allélfrakcióját (AF) különböző hígításokban hasonlítják össze, hogy meghatározzák a pontosságot (várható AF vs. megfigyelt AF), a precizitást (az ismétlések közötti AF-változtatást) és az elérhető legalacsonyabb kimutatási határt. Az assay reprodukálhatóságának tesztelésére a tervezett klinikai felhasználás során a szekvenálást meg kell ismételni a 30 felhasznált mintán, az 1. cél, amely a tumor MAF-ek széles skáláját fogja fel. A szponzor kiszámítja az ismétlések közötti variációs együtthatót. Pilóta tanulmányok alapján A szponzor kiváló reprodukálhatóságra számít (CV<5%). 3. cél. Mintagyűjtés. A II. fázisban javasolt minták gyűjtését az IRB/Etikai Bizottság megfelelő jóváhagyásával kezdik meg minden részt vevő intézménynél.

A gyűjtés után a mintákat a Bécsi Orvostudományi Egyetem Rákkutató Intézetébe szállítják, ahol UtL szűrést és DNS-kivonást végeznek.

A Pap-kenetből és a perifériás leukocitákból párosított DNS-t is kivonnak. Az izolált DNS-ekhez de azonosító számot rendelnek, és elküldik a TwinStrand részére a duplex szekvenálás céljából.

I. fázis mérföldkövek:

1. Erősítse meg az UtL-szűrés hasznosságát a tumormutáció dúsításában.
2. Számszerűsítse az egyszerűsített assay pontosságát, pontosságát, alsó kimutatási határát és reprodukálhatóságát UtL-eken.
3. Indítsa el a mintagyűjtést a II. fázishoz.

I. fázisú termékek:

1. A DS munkafolyamat készen áll az UtL DNS-re történő alkalmazásra kereskedelmi méretekben a II. és a III. fázisban.
2. Mintabank a II. fázishoz

FÁZIS II. Megvizsgáljuk és statisztikailag modellezzük azokat az előre meghatározott paramétereket, amelyek befolyásolhatják a TP53 mutációs gyakoriságának érzékenységét és specificitását. A klinikai szenzitivitást és specifitást maximalizálják, ha személyre szabott diagnosztikai küszöb statisztikai modelleket építenek fel, amelyek többváltozós klinikai jellemzőket, valamint az egyes egyének egyedi háttérmutációs terhelését a leukocita szekvenáláson alapuló egyedi háttérmutációs terhelés alapján teszik lehetővé. A betegek egy részében megerősítik az UtL jobb teljesítményét a Pap-kenet mintavételénél. Ezen túlmenően egy bizonyítási koncepció vizsgálatot végeznek a bevont betegek egy alcsoportján, hogy tanulmányozzák az UtL-ekben és a megfelelő tumorszövetekben/STIC-kben a HGSC szempontjából releváns 96 metilációs markert.

CÉL 1. ÁLTALÁNOS POPULÁCIÓ OVARIANARÁK SZŰRÉS Ez a cél egy biomarker kifejlesztése a HGSC kimutatására egy átlagos kockázatú populációban. A szponzor egy eset-kontroll vizsgálatot fog végezni, amely integrálja a TP53 DS mutációs adatokat a klinikai patológiai információkkal annak érdekében, hogy maximális érzékenységgel és specifitással azonosítsa a HGSC-ben szenvedő nőket. A HGSC-k több mint 98%-a mutációt hordoz a TP53-ban, ami azt jelenti, hogy az ultramély DS költséghatékonyan csak egy kis genomi régióra fókuszálható. Ennek a célnak a terméke egy 200 páciens biomarker adatkészlete lesz, amely bemutatja ennek a kritikusan szükséges petefészekrák-diagnosztikának a költséghatékony, kereskedelmileg robusztus teljesítményét.

1A. cél: A TP53 DS tesztteljesítményének felmérése UtL-eken HGSC kimutatására átlagos kockázatú betegeknél.

Módszerek: Az átlagos kockázatú populációból származó 200 alany UtL mintáit DS-en keresztül elemzik: 100 alany HGSC-vel (esetek) és 100 alany olyan elváltozásokkal, amelyek végül jóindulatúnak bizonyultak a reszekció után, azaz rák nélkül (kontroll). Minden betegnél az UtL-t le kell gyűjteni a sebészeti beavatkozás előtt petefészektömeg megállapítására. Az öblítést a menstruációs ciklus luteális fázisában kell elvégezni, ha a menopauza előtt van. A műtéti minták patológiás értékelése megtörténik, és a szövettani eredményektől függően HGSC pozitívnak vagy kontrollnak számítanak. Rákbetegek esetében az elsődleges daganatot hagyományos módszerekkel szekvenálja a Bécsi Orvostudományi Egyetem a TP53, BRCA1 és BRCA2 géneket tartalmazó panel alapján. Az összes azonosítatlan betegminta esetében az összegyűjtött klinikai adatok a következőket tartalmazzák: életkor, dohányzási előzmények, korábbi kemoterápiás expozíció, paritás, menopauza kora, menstruáció kora, orális fogamzásgátló használat kórtörténete, rák családtörténete és hét az elsődleges daganat génmutációs állapota. Az eseteket és a kontrollokat korrigálni kell, és a lehető legszélesebb korosztályt figyelembe kell venni az életkor érzékenységre és specifitásra gyakorolt ​​hatásának felmérésére.

Statisztikai elemzés: Minden egyes mintához részletes mutációs profil készül a duplex szekvenálás kimeneti fájljaiból, beleértve: mutáns allélfrekvenciát (MAF) az összes mutált pozícióra, mutációs spektrumot, előre jelzett patogenitást a fehérje működésére, kapcsolatot az ismert hotspotokkal és a teljes mutációs terhelést. (a mutáns nukleotidok száma osztva a szekvenált nukleotidok teljes számával). Ezt követően a minták vakolása az eset-ellenőrzés állapota szempontjából megtörténik. Az UtL-ek által gyűjtött DNS-ből származó TP53 MAF előrejelzőként szolgál majd az átlagos kockázatú betegek (AIM I) megkülönböztetésére HGSC-vel és anélkül, logisztikus regressziós modellezéssel. Az életkor, a dohányzás kórtörténete, a korábbi kemoterápiás expozíció, a paritás, a menopauza kora, a menstruáció kora, az orális fogamzásgátlás kórtörténete, a rák családtörténete és a csíravonal mutációs státusza potenciális zavaró tényezőnek tekinthető. A modell előrejelzését keresztellenőrzéssel értékeljük. Analóg elemzést alkalmazunk a magas kockázatú betegek csoportjára (AIM II), ahol a STIC jelenléte és hiánya határozza meg a kimeneti változót. A mutáns allélgyakoriság határértékeit mindkét esetben javasoljuk, és a specificitást és az érzékenységet megfelelő konfidenciaintervallumokkal együtt becsüljük meg.

1B. cél: A diagnosztikai teljesítmény javítása személyre szabott kalibrációval a háttérmutációs terhelés alapján.

A DS példátlan érzékenysége arra az új felfedezésre vezetett, hogy a rákszerű mutációk nagyon alacsony szinten halmozódnak fel az életkorral több emberi szövetben. Egy kísérleti tanulmányban a szponzor felfedezte, hogy az átlagos BB mutációs terhelés valamivel magasabb az UtL-ekben, mint más szövetekben, valószínűleg az endometrium szövetből származó DNS-hozzájárulás miatt, amely a menopauza előtt nagymértékben replikálódik. Noha ez a kísérleti vizsgálatban nem veszélyeztette a specifikusságot, a szponzor felismerte, hogy a BB akadályt jelenthet néhány nagyon korai daganat esetén, ahol alacsony a MAF-jel, vagy nagyon idős nőknél, ahol a háttér magas. A szponzor arra számít, hogy a menopauza előtti nőknél az öblítő szűrés és a luteális fázis összegyűjtése csökkenti a BB jelet, de további intézkedésként a szponzor megvizsgálja, hogy a teljesítmény tovább javítható-e az egyén háttérmutációs terhelésének normalizálásával. A szponzor feltételezi, hogy a keringő leukociták TP53 mutációinak szintje empirikusan mért személyi kalibrátorként szolgálhat, amely nemcsak a BB-t növelő ismert tényezőket rögzíti, mint például az életkor, hanem az ismeretlen mutagén expozíciót vagy más, az ember élete során előforduló tényezőket is. Bár a leukocitákból származó DNS valószínűleg csak minimális mértékben járul hozzá az UtL-ekben található BB-mutációk teljes készletéhez, a szponzor azt állítja, hogy ezek a közmondás szerint „kanári a szénbányában” szolgálhatnak, amely arányosan reprezentálja a BB-mutációkat a szervezetben máshol. Maga a BB-mutáció terhelése egy mosásban nem mérhető közvetlenül valós környezetben, ha a daganat által okozott mutáció(k) ismeretlenek. Ennek a koncepciónak a hitelességét a peritoneális folyadékban előforduló TP53 mutációkkal kapcsolatos kezdeti vizsgálatunk mutatta, amely egyező vérminták egy részét tartalmazta, és erős összefüggést mutatott a BB és az életkor között.

Módszerek: A perifériás vér mononukleáris sejtjei (PBMC) komponenséből származó DNS-t - amelyet közvetlenül a műtét előtt gyűjtöttek össze - 100 HGSC esetből véletlenszerűen kiválasztott 50-ből és 1A célból 100 kontrollból 50-ből kivonják és TP53 DS-nek vetik alá ~10 000-szeres molekuláris értékkel. mélység. A PBMC-kből származó TP53 mutációkat levonjuk az UtL-ben található TP53 mutációkból.

Statisztikai elemzés: A szponzor megvizsgálja az UtL-ben előforduló TP53 mutációs gyakoriságok és a leukociták közötti összefüggést, és megállapítja, hogy az 1A cél álnegatív eredményei megfelelnek-e a leukocitákban megnövekedett BB-vel járó eseteknek. Ezenkívül a szponzor elemzi a leukociták TP53 mutációinak gyakoriságát az esetek kontrollállapotának előrejelzőjeként, ismét a 10%-os kihagyás eljárást alkalmazva. Ezt az innovatív kalibrációs módszert a fix mutációs frakciót használó egyváltozós modellel elért egyszerű ROC mérőszámokkal, valamint a páciens egyéb jellemzői, például életkora alapján kifejlesztett módosított többváltozós modellel fogják összehasonlítani. A jelen célokkal nem összefüggő tudományos kérdésként a szponzorok kíváncsiak arra, hogy a leukocita TP53 mutációs terhelés független előrejelzőjeként szolgál-e a beteg életkorának, általános egészségi állapotának vagy a mutagén expozíció történetének.

Cél: 1C. A méhmosás diagnosztikai teljesítményének összehasonlítása a Pap-kenetből vett DNS-sel.

Az első jelentés az NGS-ről a petefészekrák kimutatására transzvaginális folyékony biopsziából történő alkalmazásáról a Pap-kenet gyűjtésén és a SafeSeqS-en alapult, mint szekvenálási technológián. Az idézett 41%-os érzékenység fontos elvi bizonyítékot adott, de bőven volt még javítanivaló is. A szponzor határozottan bebizonyította a DS jobb pontosságát a SafeSeqS-hez hasonló módszerekkel szemben, és a laborunkban folyamatban lévő vizsgálatok azt mutatják, hogy a Pap-kenetek korlátozott érzékenysége az UtL-hez képest. Mindazonáltal a két gyűjtési módszer közvetlen összehasonlítása ugyanazon betegeken még hátravan. Az UtL felsőbbrendűségének formális bemutatása a Pap-kenetekkel szemben elősegíti a kereskedelmi piacra lépést (a szponzor megjegyzi, hogy a kapcsolódó NCI SBIR-t a PapGene Inc., a fent említett tanulmány szerzői által alapított cég kapott). Az UtL felsőbbrendűsége az alapján várható, hogy az öblítések elérik a petevezetéket és a petefészek felszínét, míg a Pap-kenetek a méhnyakcsatornába jutó disszeminált rákos sejteken alapulnak. Mindazonáltal, abban az esetben, ha a TP53 DS a Pap-keneteken nem teljesíti drasztikusan az UtL-t, a szponzor tovább vizsgálja ezt a kiegészítő gyűjtési módszert. Mivel a Pap-kenetet rutinszerűen az alapellátást nyújtó szolgáltatók végzik, ezek felhasználásának lehetősége felgyorsíthatja a piaci bevezetést. A jelenlegi bizonyítékok azonban a Pap-kenetek valószínű alsóbbrendűségére utalnak.

Módszerek: A szponzor a fentiek szerint elvégzi a TP53 DS-t, de az 1A célból véletlenszerűen kiválasztott, életkornak megfelelő 25 rákos esetből és 25 kontrollból álló, műtét előtt gyűjtött Pap-kenetek DNS-ét használja.

Statisztikai elemzés: A TP53 MAF-re vonatkozó DNS-adatokat, amelyeket a hagyományos pap-kenet-teszttel gyűjtöttek átlagos kockázatú betegek almintájából, további előrejelzőnek tekintik az 1A és 1B célon belül kifejlesztett modellekben. A megbízó megvizsgálja, hogy van-e további lehetőség az esetek megkülönböztetésére a kontrolloktól. Pap-kenetből és UtL-ből származó információk kombinálásával nyerhető.

2. CÉL. MAGAS KOCKÁZATÚ POPULÁCIÓS OVARIANARÁK SZŰRÉS Ez a cél az 1. célhoz hasonló megközelítést alkalmaz, de az örökletes emlő- és petefészekrák (HBOC) mutációi miatt magas kockázatú nőkre összpontosít. A HBOC-os nőket az alapján azonosították, hogy a családban előfordult emlő- vagy petefészekrák, és kimutatták, hogy mutációkat hordoznak a rákra hajlamos génekben, általában a BRCA1-ben és a BRCA2-ben, amelyek 35%, 46% és 13%, 23% életre szóló HGSC kockázatot jelentenek. illetőleg. Az ellátás standardja a salpingo ophorectomia (RRSO) kockázatának csökkentése korai életkorban, jellemzően a gyermekvállalás befejezése után. Bár ez a megközelítés csökkenti a mortalitást, nem tökéletes: ebben a populációban a petefészekrák körülbelül 10%-a alakul ki 40 éves kor előtt. A bécsi esetsorozatban a rákos megbetegedések már 20 éves korban is előfordultak, ami jóval azelőtt, hogy normális esetben profilaktikus műtétet végeznének. Így még standard ellátás mellett is a HBOC-os nők reproduktív éveiben jelentősen megnövekedett petefészekrák kockázatának vannak kitéve, mint más nőknél, és még nagyobb szükségük van egy hatékony szűrőeszközre. Jelenleg az érintett nőknek el kell dönteniük, hogy elfogadják a súlyosan halálos rák megnövekedett kockázatát, vagy úgy döntenek, hogy elfelejtik (vagy idő előtt befejezik) a gyermekvállalást. Ez egy kínzó döntés, amellyel csak az Egyesült Államokban nők százezrei szembesülnek. Egyes etnikai csoportokban, különösen az askenázi zsidókban, a hordozóvá válás kockázata 1 a 40-hez. Ennek ellenére a BRCA-hordozók többségénél, még azoknál is, akiket nem végeznek műtéten, soha nem alakul ki HGSC. Sürgősen szükség van korai felismerési diagnosztikai eszközökre a HGCS magas kockázatának kitett nőknél az életek megmentése és a termékenység megóvása érdekében. Ennek a célnak a terméke egy 115 páciensből álló biomarker adatkészlet lesz, amely egy ilyen teszt kereskedelmileg megbízható teljesítményét demonstrálja.

2A cél. A TP53 DS tesztteljesítményének értékelése UtL-eken a HGSC kimutatására magas kockázatú betegeknél.

A szponzor ezt a vizsgálatot az 1A. cél általános módszerei szerint közelíti meg. Az egyik jelentős különbség az, hogy az UtL-t az RRSO-n átesett HBOC-nőktől gyűjtik, nem pedig az ismert petefészektömegű nőktől. Az RRSO után a petefészkek és a petevezetékek egy SEE-FIM néven ismert aprólékos metszési protokollon mennek keresztül, hogy gondosan megvizsgálják a szöveteket, különösen a fimbriákat STIC-ek és okkult rákok szempontjából. E magas kockázatú populációban a reszekciók nagyjából 5%-ában találhatók ilyen elváltozások. A rákcsoportba azok a nők tartoznak, akiknél STIC-ket vagy okkult daganatokat találtak a SEE-FIM során, a kontrollcsoportba azok a nők tartoznak, akiknek nincs elváltozása. Ez a vizsgálati terv innovatív abban a tekintetben, hogy nem csak a magas kockázatú nőkre összpontosít, hanem kifejezetten arra a képességre összpontosít, hogy a vizsgálati módszerünk képes kimutatni a nagyon korai stádiumú, akár mikroszkopikus méretű rákos megbetegedéseket, amikor azok továbbra is műtétileg gyógyíthatók.

Módszerek: Legfeljebb 115 örökletes, nagy kockázatú petefészekrák-szindrómában szenvedő nő UtL-mintáját DS-en keresztül elemzik: 15 STIC-ben vagy rejtett rákban szenvedő (esetek) és legfeljebb 100 rákmentes (kontroll). A tok és az irányítás az életkor szerint illeszkedik. Az UtL-ek végrehajtása közvetlenül az RRSO előtt történik. A sebészeti minták patológiás értékelése központilag szabványosított SEE-FIM protokoll segítségével történik. Az RRSO után a petefészkek és a petevezetékek egy SEE-FIM néven ismert aprólékos metszési protokollon mennek keresztül, hogy gondosan megvizsgálják a szöveteket, különösen a fimbriákat STIC-ek és okkult rákok szempontjából. A szponzor arra számít, hogy ebben a kohorszban 5-15 STIC vagy okkult rákban szenvedő nőt azonosított, és 100 azonos korú nőnél nem lesz észlelt elváltozás. A kontrolloknál kisebb rákos esetek száma tükrözi a léziópozitív műtétek alacsony százalékát és azt a mintaszámot, amelyet a szponzor projekt reálisan el tud érni. Bár nagyobb szám lenne az optimális, az ilyen minták rendkívül korlátozottak. A rákcsoportba azok a nők tartoznak, akiknél STIC-eket vagy okkult HGSC-t találtak a SEE-FIM során, a kontrollcsoportba olyan nők tartoznak, akiknek nincsenek elváltozásai Statisztikai elemzés: Ez az 1A cél szerint történik.

2B cél. Diagnosztikai küszöb kalibrálása magas kockázatú nőknél háttérmutációs terhelés alapján.

Ez az alcél ugyanazt a protokollt és statisztikai módszereket fogja használni, mint az 1B. cél, és alkalmazza azokat a 2. cél magas r i k populációjára.

Módszerek: Az összes rendelkezésre álló rákos esetből származó leukocita DNS-t és a kontrollcsoport véletlenszerűen kiválasztott 30 nőből álló alcsoportját értékelik. Jól bebizonyosodott, hogy a rosszindulatú daganatok kockázata a HBOC-s nőknél magasabb a többihez képest a DNS-javítás hibái miatt, amelyek növelik az onkogén mutációk kialakulásának valószínűségét. Ennek megfelelően a szponzor arra számít, hogy az UtL-ben és a perifériás vérben mért, nem rák eredetű háttérmutációs terhelés is arányosan emelkedhet. A vérben mért magas háttérmutációs terheléshez való igazítás különösen fontos lehet a specificitás növelése érdekében ebben a csoportban.

Statisztikai elemzés: Ez az 1B cél szerint lesz.

CÉL III Metilációs szignatúra meghatározása a HGSC detektálásához UtL-ekben. Az elmúlt 15 évben bebizonyosodott, hogy a DNS-metilációs analízis értéke az epigenetikai, daganatspecifikus változások kimutatásában, különösen a rákdiagnosztikában. A petefészekrák (OC) DNS-metilációjával kapcsolatos vizsgálatok az OC-sejtek által a véráramba juttatott DNS-fragmensek kimutatására összpontosítottak (pl. sejtmentes DNS - cfDNS) azt sugallják, hogy a cfDNS-ben lévő DNS-metilációs mintázatok képesek kimutatni az OC-k egy részét akár két évvel a diagnózis előtt. Ez a tanulmány is világosan mutatja ennek a megközelítésnek a korlátait, mivel azoknak a betegeknek csak 50%-a volt kimutatható, akiknél végül két éven belül magas fokú savós petefészekrák (HGSC) alakult ki. A mögöttes probléma az, hogy a cfDNS alacsony koncentrációja miatt a véráramban nagyon gyenge jelet kell kimutatni. A HGSC kimutatás érzékenységének potenciális növelése érdekében a szponzor Prof. Andreas Weinhäusellel, az Osztrák Technológiai Intézet (AIT) Molekuláris Diagnosztikai Kompetencia Osztályának professzorával együttműködve koncepció bizonyítási vizsgálatot fog végezni a betegek egy alcsoportján ez a projekt. Prof. Andreas Weinhäusel 96, a HGSC szempontjából releváns metilációs markert azonosított. Csak nagyon kis mennyiségű DNS szükséges a DNS-metilációhoz. A vizsgálati eljárás specificitásának és szenzitivitásának továbbfejlesztéséhez ezért célszerű a már rendelkezésre álló öblítésekből származó DNS-t és a megfelelő daganatszövetet felhasználni, amelyet jelen vizsgálat során kinyertünk. Az AIM3 terméke egy 140 páciensből álló metilációs marker adatkészlet lesz, amely egy ilyen teszt nagy érzékenységét mutatja.

Módszerek: Az UtL-ből származó genomiális DNS és 30 HGSC-betegből és 10 STIC-ből/okkult rákos megbetegedésből származó megfelelő tumorszövet metilációra érzékeny restrikciós enzimek segítségével metilált DNS-re dúsul. Ezt a DNS-t egy highthrough put-qPCR végrehajtásával elemzik, amelyben párhuzamosan 5 x 96 marker x 96 DNS kerül elemzésre. A leginkább informatív markereket metilációs aláírással kombinálják. Az UtL-ekből származó aláírás-DNS specifitásának bizonyítására 60 kontrollt elemeznek (30 átlagos kockázatú és 30 magas kockázatú eset). A DNS metilációs mintázatának értékelését a reszekció előtti öblítéseken és legfeljebb 10 STIC lézión/okkult rákon végezzük. Ha a helyi patológiai eredmények STIC-eket vagy okkult rákos sejteket (FFPE-szövet) azonosítanak, lézeres mikrodisszekciót és DNS-izolálást végeznek. Ezt követően a standard NGS TP53 szekvenálást az 1. és 2. AIM-ben leírtak szerint hajtják végre. Ebben a kísérleti alvizsgálatban nagy áteresztőképességű put-qPCR-t alkalmaznak a fennmaradó DNS-anyagra a metilációs állapot értékeléséhez.

Statisztikai elemzés: Az egyszerű PCR-vizsgálathoz szükséges DNS-metilezési szignatúra meghatározásának lehetőségének értékelése céljából a 96-plexed nagy áteresztőképességű MSREqPCR-analízisből származó dCT-PCR-értékeket bioinformatikai és biostatisztika elemzi, hogy 1) osztály-összehasonlítást végezzen a releváns klinikai adatok között. szignifikánsan eltérően metilált gének meghatározására szolgáló altípusok és osztályok; 2) többváltozós osztály-előrejelzés elemzése különböző jellemző szelekciós megközelítésekkel, egymarkeres p-értékeken alapulóan. Különféle osztályozási algoritmusok (pl. k-legközelebbi szomszéd, támogató vektor gépek, lineáris diszkriminációs elemzések stb.) 10-szeres keresztvalidációt és/vagy elhagyható keresztvalidációt alkalmaznak a legjobb jelölt metilációs markerek - és algoritmusok kiválasztásához; ezen túlmenően az egyetlen jelölt metilációs marker felső-AUC értékeit a ROC analízisben határozzák meg, és figyelembe veszik a marker kiválasztásánál.

Egy 48 jelölt markerből álló részhalmazt választunk ki megerősítésre egy külön mintakészletben. Az ezekből származó metilációs adatokat osztály-összehasonlítás és osztály-előrejelzési analízis segítségével elemezzük, hasonló módon, mint a 480-plexed elemzésből származó első adatkészletet. Meghatározzák a legjobban teljesítő egyetlen markereket és a többváltozós elemzésből származó markerek kombinációit. A besorolási eredményeket és a metilációs adatokat összehasonlítjuk a p53 mutációs teszt eredményeivel, hogy értékeljük a metiláció alapú diagnosztikai osztályozás lehetőségét, egyedüliként és a p53 mutációanalízissel kombinálva. Ezt különböző osztály-előrejelzési megközelítések alkalmazásával hajtjuk végre, integrálva mind a p53, mind a metilációs adatokat többváltozós modellekben.