使用子宫灌洗 EHUD 研究和双重测序早期检测高级别卵巢癌 (EHUD)

方法第一阶段华盛顿大学已经证明了诊断原则；然而，工业规模部署需要进一步优化和验证。 在第一阶段，将优化 UtL 过滤方法（目标 1），验证商业工作流程的分析性能（目标 2）并达到样品收集里程碑（目标 3）。 目标 1. 确定子宫灌洗过滤的效用，以最大限度地富集肿瘤来源的 DNA。 对两个样本的初步测试表明，过滤 UtLs 以去除子宫内膜细胞簇可以将对肿瘤突变的敏感性提高几倍。 该数据集将通过分析来自具有已知 TP53 突变的 HGSC 患者的 10 UtL 中的过滤效果来扩展。 每个 UtL 将被分成两半：前半部分将被过滤，第二部分将保持未过滤。 将从过滤、滤液和未过滤的部分中提取 DNA，并通过 TP53 DS 进行分析（总共 30 个样本）。 对于每个 UtL，将比较每个组分中的 DNA 产量和肿瘤突变的 MAF。 预计过滤后的部分将包含比未过滤部分更少的 DNA，但肿瘤突变将以更高的频率出现。 如果灵敏度得到提高（即通过富集获得的收益多于通过减少可用 DNA 减少损失的收益），将对所有未来收集的样本使用过滤。 目标 2. 优化检测的验证：准确度、精密度、检测限和重现性。 TwinStrand 使用改进的适配器、连接化学和高通量 96 孔板格式开发了简化的 DS 工作流程，适用于液体处理机器人并与 CLIA 实验室标准兼容。

TwinStrand 还开发了优化的基于云的分析管道，支持多个样本的自动并行处理。 将验证用于检测 UtL 样本中 TP53 突变的优化过程。 为了评估准确性、技术精度和检测下限，来自两个个体的 DNA 样本在 TP53 中或附近的 >5 个 SNP 位点的基因型不同，将以 1:100 1:5,000 的比例混合，两个 UtL。 在两个独立的实验中，混合物将在约 10,000 倍分子深度处进行测序。 将在不同稀释度下比较 SNP 等位基因分数 (AF)，以确定准确性（预期 AF 与观察到的 AF）、精确度（重复之间的 AF 变异）和可实现的最低检测限。 为了测试其预期临床用途中的测定重现性，将对目标 1 中使用的 30 个样本重复测序，其中将涵盖广泛的肿瘤 MAF。 赞助商将计算重复之间的变异系数。 基于试点研究，申办方预计具有出色的再现性（CV<5%）。 目标 3. 样本采集。 在每个参与机构的适当 IRB/伦理委员会批准下，将开始收集第二阶段建议的样本。

收集后，样本被运送到维也纳医科大学癌症研究所，该研究所将进行 UtL 过滤和 DNA 提取。

巴氏涂片和外周白细胞的配对 DNA 也将被提取。 分离出的 DNA 将分配一个识别号并运送到 TwinStrand 进行双重测序。

第一阶段里程碑：

1. 确认 UtL 过滤对肿瘤突变富集的效用。
2. 在 UtL 上量化简化检测的准确度、精密度、检测下限和重现性。
3. 开始第二阶段的样本采集。

一期产品：

1. DS 工作流程已准备好在第二阶段和第三阶段以商业规模应用于 UtL DNA。
2. 二期样本库

方法 II 期 II 期将验证在 UtLs 上使用 TP53 DS 在扩大的病例对照患者队列中检测早期卵巢癌，包括平均和高风险人群。 将检查可能影响 TP53 突变频率的灵敏度和特异性的预定义参数，并进行统计建模。 通过使用多变量临床特征以及基于白细胞测序的每个个体独特的背景突变负荷建立个性化诊断阈值统计模型，可以最大限度地提高临床敏感性和特异性。 在一部分患者中，UtL 优于巴氏涂片取样的性能将得到证实。 此外，将在包含的患者子集中进行概念验证研究，以研究 UtL 和相应肿瘤组织/STIC 中与 HGSC 相关的一组 96 种甲基化标记物。

目标 1. 一般人群卵巢癌筛查 该目标将开发用于在平均风险人群中检测 HGSC 的生物标志物。 申办者将进行一项病例对照研究，将 TP53 DS 突变数据与临床病理信息相结合，以便以最大的敏感性和特异性识别患有 HGSC 的女性。 超过 98% 的 HGSC 携带 TP53 突变，这意味着超深 DS 可以经济高效地集中在一个小的基因组区域。 这一目标的产品将是一个 200 名患者的生物标志物数据集，该数据集证明了这种急需的卵巢癌诊断具有成本效益、商业稳健的性能。

目标 1A：评估 TP53 DS 在 UtLs 上对一般风险患者进行 HGSC 检测的测试性能。

方法：将通过 DS 分析来自平均风险人群的 200 名受试者的 UtL 样本：100 名患有 HGSC 的受试者（病例）和 100 名病变最终在切除后被发现为良性的受试者，即没有癌症（对照）。 在对卵巢肿块进行外科手术之前，将收集所有患者的 UtL。 如果绝经前，灌洗将在月经周期的黄体期进行。 将对手术标本进行病理学评估，并根据组织学结果将患者计为 HGSC 阳性或对照。 对于癌症患者，原发性肿瘤将由维也纳医科大学通过常规方法对一组基因进行测序，包括 TP53、BRCA1 和 BRCA2。 对于所有未识别的患者样本，收集的临床信息将包括：年龄、吸烟史、既往化疗暴露、胎次、绝经年龄、初潮年龄、口服避孕药使用史、癌症家族史和七-原发肿瘤的基因突变状态。 病例和对照将进行年龄匹配，并且将包括尽可能广泛的年龄范围以评估年龄对敏感性和特异性的影响。

统计分析：将从双面测序输出文件生成每个样本的详细突变概况，包括：所有突变位置的突变等位基因频率 (MAF)、突变谱、对蛋白质功能的预测致病性、与已知热点的关系以及总体突变负荷（突变核苷酸的数量除以测序的核苷酸总数）。 在此之后，样本将针对病例对照状态揭盲。 来自 UtLs 收集的 DNA 的 TP53 MAF 将用作通过逻辑回归模型区分有和没有 HGSC 的平均风险患者 (AIM I) 的预测因子。 年龄、吸烟史、既往化疗暴露、胎次、绝经年龄、初潮年龄、口服避孕药使用史、癌症家族史和种系突变状态将被视为潜在的混杂因素。 模型预测将通过交叉验证进行评估。 类似的分析将应用于高风险患者组 (AIM II)，其中是否存在 STIC 定义了结果变量。 在这两种情况下都将建议突变等位基因频率的截止值，并将估计特异性和敏感性，包括适当的置信区间。

目标 1B：通过背景突变负载的个性化校准提高诊断性能。

DS 前所未有的敏感性使我们和其他人有了新发现，即癌症样突变在多个人体组织中随着年龄的增长而积累的水平非常低。 在一项试点研究中，赞助商发现 UtL 中的平均 BB 突变负荷略高于其他组织，这可能是由于子宫内膜组织的 DNA 贡献，其在绝经前广泛复制。 虽然这并没有影响试点研究的特异性，但发起人认识到 BB 可能对一些 MAF 信号低的极早期肿瘤或背景高的高龄女性构成障碍。 申办方预计绝经前妇女的灌洗过滤和黄体期收集将减少 BB 信号，但作为一项附加措施，申办方将检查是否可以通过对个体的背景突变负荷进行标准化来进一步提高性能。 赞助商假设循环白细胞中 TP53 突变的水平可以作为一个经验测量的个人校准器，它不仅可以捕获增加 BB 的已知因素，例如年龄，还可以捕获未知的诱变暴露或一个人一生中发生的其他因素。 尽管来自白细胞的 DNA 可能仅对 UtL 中的 BB 突变总量贡献极小，但发起人认为它们可以作为众所周知的“煤矿中的金丝雀”，按比例代表身体其他部位的 BB 突变。 当肿瘤引起的突变未知时，灌洗液中的 BB 突变负荷本身无法在现实环境中直接测量。 我们对腹膜液中 TP53 突变的初步研究表明了这一概念的合理性，其中包括匹配血液样本的一个子集，并表明 BB 与年龄之间存在很强的关联。

方法：外周血单核细胞 (PBMC) 成分的 DNA - 在手术前立即收集 - 从目标 1A 的 100 例 HGSC 病例中随机选择 50 例，从 100 例对照中随机选择 50 例，将提取 DNA 并在~10,000x 分子水平下进行 TP53 DS深度。 来自 PBMC 的 TP53 突变将从 UtL 中发现的 TP53 突变中减去。

统计分析：主办方将检查 UtL 中 TP53 突变频率与白细胞之间的关联，并将确定 Aim 1A 中的假阴性是否与白细胞中 BB 增加的病例相对应。 此外，申办者将分析白细胞中的 TP53 突变频率作为病例控制状态的预测指标，再次使用遗漏 10% 的程序。 这种创新的校准方法将与使用固定突变分数的单变量模型以及根据其他患者特征（如年龄）开发的调整多变量模型实现的简单 ROC 指标进行比较。 作为一个与当前目标无关的科学问题，发起人急于了解白细胞 TP53 突变负荷是否将作为患者年龄、整体健康状况或致突变暴露史的独立预测因子。

瞄准 1C。 子宫灌洗与巴氏涂片收集的 DNA 诊断性能的比较。

使用 NGS 从经阴道液体活检检测卵巢癌的第一份报告依赖巴氏涂片收集和 SafeSeqS 作为测序技术。 引用的 41% 的灵敏度提供了重要的原理证明，但也有很大的改进空间。 发起人已明确证明 DS 优于 SafeSeqS 之类的方法，并且我们实验室正在进行的研究表明与 UtL 相比，巴氏涂片的敏感性有限。 然而，对同一患者的两种收集方法的直接比较仍有待进行。 正式证明 UtL 优于巴氏涂片的程度将有助于进入商业市场（赞助商指出，相关的 NCI SBIR 已授予 PapGene Inc，一家由上述研究的作者创立的公司）。 基于灌洗液到达输卵管和卵巢表面这一事实，预计 UtL 的优越性，而巴氏涂片依赖于扩散的癌细胞到达宫颈管。 然而，如果巴氏涂片上的 TP53 DS 没有明显低于 UtL，申办者将进一步探索这种补充收集方法。 由于子宫颈抹片检查通常由初级保健提供者执行，因此使用这些检查的能力有助于加速市场采用。 然而，目前的证据表明子宫颈抹片检查可能存在劣势。

方法：申办者将如上所述进行 TP53 DS，但使用手术前收集的巴氏涂片 DNA，这些样本是随机选择的、年龄匹配的 25 例癌症病例和来自目标 1A 的 25 例对照。

统计分析：通过常规子宫颈抹片检查从平均风险患者的子样本中收集的 DNA 中的 TP53 MAF 数据将被视为在目标 1A 和 1B 内开发的模型中的额外预测因子。赞助商将调查是否有任何额外的权力来区分病例和对照可以通过结合巴氏涂片和 UtL 的信息获得。

目标 2. 高风险人群卵巢癌筛查 该目标将采用与目标 1 类似的方法，但将重点关注因遗传性乳腺癌和卵巢癌 (HBOC) 突变而具有卵巢癌高风险的女性。 HBOC 女性将通过强烈的乳腺癌或卵巢癌家族史被识别出来，并被发现携带癌症易感基因突变，通常是 BRCA1 和 BRCA2，这导致终生 HGSC 风险分别为 35%、46% 和 13%、23%、分别。 护理标准是在早期进行降低风险的输卵管卵巢切除术 (RRSO)，通常是在完成生育后。 虽然这种方法确实降低了死亡率，但它并不完美：该人群中大约 10% 的卵巢癌在 40 岁之前发生。 在 Vienna 病例系列中，癌症发病年龄低至 20 岁，这远远早于通常进行预防性手术的年龄。 因此，即使采用标准护理，与其他女性相比，处于育龄期的 HBOC 女性患卵巢癌的风险显着升高，她们对有效筛查工具的需求甚至更大。 目前，受影响的妇女必须做出决定，要么接受增加患高度致命癌症的风险，要么选择忘记（或过早结束）生育。 这是一个极具挑战性的决定，仅在美国就有数十万女性面临。 在某些种族群体中，尤其是德系犹太人，成为携带者的风险高达 40 分之一。 然而，大多数 BRCA 携带者，即使是那些没有接受过手术的人，也永远不会发展为 HGSC。 迫切需要 HGCS 高风险女性的早期检测诊断工具，以挽救生命并保留生育选择权。 这一目标的产品将是一个 115 名患者的生物标志物数据集，该数据集证明了这种测定的商业稳健性能。

目标 2A。 评估 TP53 DS 在 UtL 上用于高危患者 HGSC 检测的测试性能。

申办者将按照目标 1A 的一般方法进行这项研究。 一个显着差异是 UtL 将从接受 RRSO 的 HBOC 女性中收集，而不是从已知卵巢肿块的女性中收集。 在 RRSO 之后，卵巢和输卵管会进行称为 SEE-FIM 的细致切片方案，以仔细检查组织，尤其是伞毛，以发现 STIC 和隐匿性癌症。 在这个高风险人群中，大约 5% 的切除术中发现了此类病变。 癌症组将包括在 SEE-FIM 期间发现 STIC 或隐匿性肿瘤的女性，对照组将包括没有病变的女性。 这项研究设计的创新之处在于，它不仅关注高风险女性，而且特别关注我们的检测方法检测极早期癌症（甚至可能是微观癌症）的能力，前提是它们仍可通过手术治愈。

方法：来自多达 115 名患有遗传性高风险卵巢癌综合征的女性的 UtL 样本将通过 DS 进行分析：15 名患有 STIC 或隐匿性癌症（病例）和多达 100 名无癌症（对照）。 病例和对照将按年龄匹配。 UtLs 将在 RRSO 之前立即执行。 手术标本将通过集中标准化的 SEE-FIM 协议进行病理学评估。 在 RRSO 之后，卵巢和输卵管会进行称为 SEE-FIM 的细致切片方案，以仔细检查组织，尤其是伞毛，以发现 STIC 和隐匿性癌症。 申办者预计在该队列中确定 5 至 15 名患有 STIC 或隐匿性癌症的女性，100 名年龄匹配的女性将没有检测到病变。 癌症病例数少于对照病例数反映了病变阳性手术的百分比较低以及发起人项目实际能够实现的样本数。 虽然更大的数量是最佳的，但这样的样本极其有限。 癌症组将包括在 SEE-FIM 期间发现 STIC 或隐匿性 HGSC 的女性 对照组将包括没有病变的女性 统计分析：这将按照目标 1A。

瞄准 2B。 通过背景突变负荷对高危女性的诊断阈值校准。

该子目标将使用与目标 1B 相同的协议和统计方法，并将其应用于目标 2 的高风险人群。

方法：将评估来自所有可用癌症病例和随机选择的 30 名女性对照组的白细胞 DNA。 众所周知，由于 DNA 修复缺陷增加了致癌突变发生的可能性，因此 HBOC 女性患恶性肿瘤的风险相对于其他女性更高。 因此，发起人预计在 UtL 和外周血中测量的非癌症衍生背景突变负荷也可能按比例升高。 调整血液中测量的高背景突变负荷对于提高该组的特异性可能特别重要。

统计分析：这将按照目标 1B。

AIM III 为 UtL 中的 HGSC 检测定义甲基化特征。 在过去的 15 年中，DNA 甲基化分析在检测表观遗传、肿瘤特异性变化方面的价值得到了证明，尤其是在癌症诊断方面。 卵巢癌 (OC) 中 DNA 甲基化的研究侧重于检测 OC 细胞脱落到血液中的 DNA 片段（即 cell-free DNA - cfDNA) 表明 cfDNA 中的 DNA 甲基化模式有可能在诊断前长达两年检测到一定比例的 OC。 这项研究还清楚地表明了这种方法的局限性，因为在两年内最终发展为高级别浆液性卵巢癌 (HGSC) 的所有患者中，只有 50% 可以被检测到。 根本问题在于，由于血液中 cfDNA 的浓度较低，因此需要检测非常微弱的信号。 为了潜在地提高 HGSC 检测的灵敏度，申办方将与奥地利理工学院 (AIT) 分子诊断能力部门的 Andreas Weinhäusel 教授合作，对包括在这个项目。 Andreas Weinhäusel 教授鉴定了 96 个与 HGSC 相关的甲基化标记。 DNA 甲基化只需要极少量的 DNA。 因此，建议使用在本研究过程中提取的灌洗液和相应肿瘤组织中已经可用的 DNA，以进一步开发测试程序的特异性和灵敏度。 AIM3 的产品将是一个包含 140 个患者甲基化标记物的数据集，该数据集展示了这种检测的高灵敏度性能。

方法：来自 30 例 HGSC 患者和 10 例 STIC/隐匿性癌症的 UtLs 和相应肿瘤组织的基因组 DNA 将在甲基化敏感性限制酶的帮助下富集甲基化 DNA。 该 DNA 将通过执行高通量 put-qPCR 进行分析，其中将平行分析 5 x 96 标记 x 96 DNA。 信息量最大的标记将组合成甲基化特征。 为了证明来自 UtL 的签名 DNA 的特异性，将分析来自 60 个对照（30 个平均风险和 30 个高风险案例）。 将对切除前灌洗液和多达 10 个 STIC 病变/隐匿性癌症进行 DNA 甲基化模式评估。 当局部病理结果发现 STIC 或隐匿性癌细胞（FFPE 组织）时，将进行激光显微切割和 DNA 分离。 随后应用标准 NGS TP53 测序将按照 AIM 1 和 AIM 2 中的描述进行。在此试点子研究中，高通量 qPCR 将应用于剩余的 DNA 材料以评估甲基化状态。

统计分析：旨在评估为简单 PCR 测试定义 DNA-甲基化特征的潜力，来自 96 重高通量 MSREqPCR 分析的 dCT-PCR 值将通过生物信息学和生物统计学进行分析，以进行 1) 相关临床之间的类别比较用于定义显着差异甲基化基因的亚型和类别； 2) 使用基于单标记 p 值的不同特征选择方法的多变量类别预测分析。 不同的分类算法（例如 k-最近邻、支持向量机、线性辨别分析等）将被应用，使用 10 倍交叉验证和/或留一法交叉验证来选择最佳候选甲基化标记 - 和算法；此外，单个候选甲基化标记的最高 AUC 值将在 ROC 分析中定义，并考虑用于标记选择。

将选择 48 个候选标记的子集在单独的样本集中进行确认。 以与源自480plexed分析的第一组数据类似的方式，使用类别比较和类别预测分析来分析由此获得的甲基化数据。 将定义来自多变量分析的表现最佳的单个标记和标记组合。 分类结果和甲基化数据将与 p53 突变测试结果进行比较，以评估基于甲基化的诊断分类的潜力，作为唯一的并与 p53 突变分析相结合。 这将通过在多变量模型中整合 p53 和甲基化数据的不同类别预测方法来进行。