Detección temprana de cáncer de ovario de alto grado mediante estudio EHUD de lavado uterino y secuenciación dúplex (EHUD)

ENFOQUE FASE I La Universidad de Washington ha demostrado un principio de prueba diagnóstica; sin embargo, se necesita una mayor optimización y validación para la implementación a escala industrial. En la Fase I, se optimizará el método de filtración UtL (Objetivo 1), se validará el rendimiento analítico en el flujo de trabajo comercial (Objetivo 2) y se cumplirá un hito de recolección de muestras (Objetivo 3). Objetivo 1. Determinar la utilidad de la filtración de lavado uterino para maximizar el enriquecimiento de ADN derivado del tumor. Las pruebas preliminares con dos muestras indicaron que la filtración de UtL para eliminar grupos de células endometriales podría aumentar varias veces la sensibilidad a las mutaciones tumorales. Este conjunto de datos se ampliará analizando el efecto de filtración en 10 UtL de pacientes con HGSC con mutaciones conocidas de TP53. Cada UtL se dividirá por la mitad: la primera mitad se filtrará y la segunda permanecerá sin filtrar. El ADN se extraerá de las fracciones filtradas, filtradas y sin filtrar y se analizará mediante TP53 DS (un total de 30 muestras). Para cada UtL se comparará el rendimiento de ADN en cada una de las fracciones y el MAF de la mutación tumoral. Se anticipa que la fracción filtrada contendrá menos ADN que la fracción no filtrada, pero la mutación tumoral estará presente con mayor frecuencia. Si se mejora la sensibilidad (es decir, se gana más con el enriquecimiento de lo que se pierde con la reducción de menos ADN disponible), se utilizará la filtración en todas las futuras muestras recolectadas. Objetivo 2. Validación del ensayo optimizado: exactitud, precisión, límite de detección y reproducibilidad. TwinStrand ha desarrollado un flujo de trabajo de DS optimizado utilizando adaptadores mejorados, química de ligadura y un formato basado en placas de 96 pocillos de alto rendimiento apto para robots de manipulación de líquidos y compatible con los estándares de laboratorio CLIA.

TwinStrand también ha desarrollado una canalización de análisis optimizada basada en la nube que admite el procesamiento paralelo automatizado de múltiples muestras. Se validará el proceso optimizado para la detección de mutaciones TP53 en muestras de UtL. Para evaluar la precisión, la precisión técnica y el límite inferior de detección, se mezclarán muestras de ADN de dos individuos que difieren en el genotipo en >5 sitios SNP en o cerca de TP53, en proporciones de 1:100 1:5000, dos UtL. Las mezclas se secuenciarán a ~10 000 veces la profundidad molecular en dos experimentos independientes. La fracción alélica (AF) de SNP se comparará en diferentes diluciones para determinar la precisión (FA esperada frente a la FA observada), precisión (variación de AF entre repeticiones) y el límite de detección más bajo alcanzable. Para probar la reproducibilidad del ensayo en su uso clínico previsto, la secuenciación se repetirá en las 30 muestras utilizadas en el Objetivo 1, que abarcará una amplia gama de MAF tumorales. El Patrocinador calculará el coeficiente de variación entre réplicas. Basado en estudios piloto, el patrocinador anticipa una excelente reproducibilidad (CV<5%). Objetivo 3. Recogida de muestras. La recolección de muestras propuestas en la Fase II se iniciará con la aprobación apropiada del Comité de Ética/IRB en cada institución participante.

Después de la recolección, las muestras se envían al Instituto de Investigación del Cáncer de la Universidad Médica de Viena, que realizará la filtración UtL y la extracción de ADN.

También se extraerá ADN emparejado de frotis de Papanicolaou y leucocitos periféricos. A los ADN aislados se les asignará un número de identificación y se enviarán a TwinStrand para la secuenciación dúplex.

Hitos de la Fase I:

1. Confirme la utilidad de la filtración UtL en el enriquecimiento de mutaciones tumorales.
2. Cuantifique la exactitud, la precisión, el límite inferior de detección y la reproducibilidad del ensayo simplificado en UtL.
3. Iniciar toma de muestras para la Fase II.

Productos Fase I:

1. Flujo de trabajo de DS listo para su aplicación a UtL DNA a escala comercial en Fase II y Fase III.
2. Banco de muestras para la Fase II

ENFOQUE FASE II La fase II validará el uso de TP53 DS en UtLs para la detección temprana de cáncer de ovario en cohortes de pacientes de control de casos ampliadas que abarcan poblaciones de riesgo promedio y alto. Los parámetros predefinidos que pueden afectar la sensibilidad y la especificidad de la frecuencia de mutación de TP53 se examinarán y modelarán estadísticamente. La sensibilidad y la especificidad clínicas se maximizarán mediante la creación de modelos estadísticos de umbral de diagnóstico personalizados utilizando características clínicas multivariadas, así como la carga de mutación de fondo única de cada individuo basada en la secuenciación de leucocitos. En un subconjunto de pacientes, se confirmará el rendimiento superior de UtL sobre el muestreo de frotis de Papanicolaou. Además, se realizará un estudio de prueba de concepto en un subconjunto de pacientes incluidos para estudiar un conjunto de 96 marcadores de metilación relevantes para HGSC en UtL y el tejido tumoral/STIC correspondiente.

OBJETIVO 1. TAMIZAJE DE CÁNCER DE OVARIO EN POBLACIÓN GENERAL Este objetivo desarrollará un biomarcador para la detección de HGSC en una población de riesgo promedio. El patrocinador llevará a cabo un estudio de control de casos que integre los datos mutacionales de TP53 DS con información patológica clínica para identificar a las mujeres con HGSC con la máxima sensibilidad y especificidad. Más del 98 % de los HGSC portan mutaciones en TP53, lo que significa que el DS ultraprofundo se puede enfocar de manera rentable solo en una pequeña región genómica. El producto de este objetivo será un conjunto de datos de biomarcadores de 200 pacientes que demuestre el rendimiento rentable y comercialmente sólido de este diagnóstico de cáncer de ovario tan necesario.

Objetivo 1A: Evaluar el rendimiento de la prueba de TP53 DS en UtLs para la detección de HGSC en pacientes de riesgo promedio.

Métodos: Se analizarán muestras UtL de 200 sujetos de la población de riesgo promedio a través de DS: 100 sujetos con HGSC (casos) y 100 sujetos con lesiones que finalmente se encontraron benignas después de la resección, es decir, sin cáncer (controles). En todas las pacientes se recogerá UtL previa intervención quirúrgica por una masa ovárica. El lavado se realizará durante la fase lútea del ciclo menstrual si es premenopáusica. Las muestras quirúrgicas se evaluarán anatomopatológicamente y se contará al paciente como HGSC positivo o como control, según los resultados histológicos. Para los pacientes con cáncer, el tumor primario será secuenciado a través de métodos convencionales por la Universidad Médica de Viena para un panel de genes que incluye TP53, BRCA1 y BRCA2. Para todas las muestras de pacientes anónimos, la información clínica recopilada incluirá: edad, antecedentes de tabaquismo, exposición previa a la quimioterapia, paridad, edad de la menopausia, edad de la menarquia, antecedentes de uso de anticonceptivos orales, antecedentes familiares de cáncer y siete años. estado de mutación genética del tumor primario. Los casos y los controles se equipararán por edad y se incluirá un rango de edad lo más amplio posible para evaluar el efecto de la edad sobre la sensibilidad y la especificidad.

Análisis estadístico: se generará un perfil de mutación detallado para cada muestra a partir de los archivos de salida de secuenciación dúplex, que incluye: frecuencia de alelo mutante (MAF) para todas las posiciones mutadas, espectro de mutación, patogenicidad prevista para la función de la proteína, relación con puntos críticos conocidos y carga de mutación general (número de nucleótidos mutantes dividido por el número total de nucleótidos secuenciados). Después de esto, las muestras serán desenmascaradas para el estado de casos y controles. TP53 MAF del ADN recolectado por UtLs se usará como predictor para diferenciar entre pacientes de riesgo promedio (AIM I) con y sin HGSC mediante modelos de regresión logística. La edad, los antecedentes de tabaquismo, la exposición previa a la quimioterapia, la paridad, la edad de la menopausia, la edad de la menarquia, los antecedentes de uso de anticonceptivos orales, los antecedentes familiares de cáncer y el estado de mutación de la línea germinal se considerarán como posibles factores de confusión. La predicción del modelo se evaluará mediante validación cruzada. Se aplicará un análisis análogo al grupo de pacientes de alto riesgo (AIM II) donde la presencia y ausencia de STIC es la variable de resultado definitoria. Se sugerirán valores de corte para la frecuencia de alelos mutantes en ambos casos y se estimarán la especificidad y la sensibilidad, incluidos los intervalos de confianza apropiados.

Objetivo 1B: Mejorar el rendimiento del diagnóstico con calibración personalizada por carga de mutación de fondo.

La sensibilidad sin precedentes de DS nos llevó luego a otros al descubrimiento novedoso de que las mutaciones similares al cáncer se acumulan en niveles muy bajos con la edad en múltiples tejidos humanos. En un estudio piloto, el patrocinador descubrió que la carga de mutación promedio de BB es algo más alta en UtL que en otros tejidos, posiblemente debido a la contribución del ADN del tejido endometrial, que se replica ampliamente antes de la menopausia. Si bien esto no comprometió la especificidad en el estudio piloto, el patrocinador reconoce que BB podría representar un obstáculo con algunos tumores muy tempranos donde la señal MAF es baja, o con mujeres muy ancianas donde el fondo es alto. El patrocinador espera que la filtración de lavado y la recolección de la fase lútea en mujeres premenopáusicas reduzcan la señal de BB, pero como medida adicional, el patrocinador examinará si se puede mejorar aún más el rendimiento al normalizar la carga de mutación de fondo de un individuo. El patrocinador plantea la hipótesis de que el nivel de mutaciones de TP53 en los leucocitos circulantes puede servir como un calibrador personal medido empíricamente que captura, no solo los factores conocidos que aumentan el BB, como la edad, sino también exposiciones mutagénicas desconocidas u otros factores que ocurren durante la vida de una persona. Aunque el ADN de los leucocitos probablemente solo contribuya en una cantidad mínima al grupo total de mutaciones BB en UtL, el patrocinador postula que pueden servir como un proverbial "canario en una mina de carbón" que será proporcionalmente representativo de las mutaciones BB en otras partes del cuerpo. La carga de mutación de BB en un lavado, en sí misma, no se puede medir directamente en un entorno real cuando se desconocen las mutaciones aportadas por un tumor. La plausibilidad de este concepto fue demostrada por nuestro estudio inicial de las mutaciones de TP53 en el líquido peritoneal, que incluyó un subconjunto de muestras de sangre coincidentes e indicó una fuerte asociación entre BB y la edad.

Métodos: El ADN del componente de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), recolectado inmediatamente antes de una cirugía, de 50 elegidos al azar de 100 casos de HGSC y 50 de 100 controles del objetivo 1A se extraerá y se someterá a TP53 DS a ~10 000x molecular profundidad. Las mutaciones de TP53 de las PBMC se restarán de las mutaciones de TP53 encontradas en la UtL.

Análisis estadístico: El Promotor examinará la asociación entre las frecuencias de mutación de TP53 en UtL y leucocitos y determinará si los falsos negativos en el Objetivo 1A corresponden a casos con aumento de BB en leucocitos. Además, el patrocinador analizará las frecuencias de mutación de TP53 en los leucocitos como predictor del estado de los casos y controles, utilizando nuevamente el procedimiento de omisión del 10 %. Este innovador método de calibración se comparará con las métricas ROC simples logradas con el modelo univariante utilizando una fracción de mutación fija, así como con el modelo multivariante ajustado desarrollado en función de otras características del paciente, como la edad. Como cuestión científica no relacionada con los objetivos actuales, el patrocinador está ansioso por ver si la carga de mutación de leucocitos TP53 servirá como predictor independiente de la edad del paciente, la salud general o el historial de exposiciones mutagénicas.

Objetivo 1C. Comparación del rendimiento diagnóstico del lavado uterino frente al ADN obtenido mediante frotis de Papanicolaou.

El primer informe sobre el uso de NGS para la detección de cáncer de ovario a partir de una biopsia líquida transvaginal se basó en la recolección de frotis de Papanicolaou y SafeSeqS como tecnología de secuenciación. La citada sensibilidad del 41% proporcionó una importante prueba de principio, pero también un amplio margen de mejora. El patrocinador ha demostrado definitivamente la precisión superior de DS sobre los métodos similares a SafeSeqS y los estudios en curso en nuestro laboratorio indican una sensibilidad limitada de las pruebas de Papanicolaou en comparación con UtL. Sin embargo, queda por realizar una comparación directa de los dos métodos de recolección en los mismos pacientes. Demostrar formalmente el grado de superioridad de UtL sobre las pruebas de Papanicolaou ayudará con la entrada al mercado comercial (el patrocinador señala que un NCI SBIR relacionado se ha otorgado a PapGene Inc, una empresa fundada por los autores del estudio mencionado anteriormente). Se espera que la superioridad de UtL se base en el hecho de que los lavados alcanzan las trompas de Falopio y las superficies ováricas, mientras que las pruebas de Papanicolaou se basan en células cancerosas diseminadas que llegan al canal cervical. No obstante, en el caso de que TP53 DS en las pruebas de Papanicolaou no tenga un desempeño drásticamente inferior al UtL, el patrocinador exploraría más a fondo este método de recolección complementario. Debido a que los proveedores de atención primaria realizan rutinariamente las pruebas de Papanicolaou, la capacidad de usarlas podría ayudar a acelerar la adopción en el mercado. Sin embargo, la evidencia actual apunta a la probable inferioridad de las pruebas de Papanicolaou.

Métodos: El patrocinador llevará a cabo TP53 DS como se indicó anteriormente, pero utilizando ADN de frotis de Papanicolaou recolectados antes de la cirugía de un subconjunto de 25 casos de cáncer y 25 controles seleccionados al azar y emparejados por edad del Objetivo 1A.

Análisis estadístico: Los datos sobre TP53 MAF del ADN recopilados mediante pruebas de Papanicolaou convencionales de una submuestra de pacientes de riesgo promedio se considerarán como predictores adicionales en los modelos desarrollados dentro de los objetivos 1A y 1B. El patrocinador investigará si existe algún poder adicional para discriminar los casos de los controles. se puede obtener combinando la información de las pruebas de Papanicolaou y UtL.

OBJETIVO 2. TAMIZAJE DE CÁNCER DE OVARIO EN POBLACIÓN DE ALTO RIESGO Este objetivo adoptará un enfoque similar al del Objetivo 1, pero se centrará en mujeres con alto riesgo de cáncer de ovario debido a mutaciones hereditarias de cáncer de mama y ovario (HBOC). Las mujeres HBOC habrán sido identificadas por un fuerte historial familiar de cáncer de mama o de ovario y se habrá encontrado que portan mutaciones en los genes de susceptibilidad al cáncer, generalmente BRCA1 y BRCA2, que confieren un riesgo de HGSC de por vida del 35%, 46% y 13%, 23%, respectivamente. El estándar de atención es la ooforectomía con salpingo para reducir el riesgo (RRSO, por sus siglas en inglés) a una edad temprana, generalmente después de completar la maternidad. Aunque este enfoque disminuye la mortalidad, es imperfecto: aproximadamente el 10 % de los cánceres de ovario en esta población se desarrollan antes de los 40 años. En la serie de casos de Viena, se han observado cánceres a una edad tan temprana como los 20 años, mucho antes de que normalmente se hubiera llevado a cabo una cirugía profiláctica. Por lo tanto, incluso con el estándar de atención, las mujeres HBOC en sus años reproductivos tienen un riesgo significativamente mayor de cáncer de ovario en relación con otras mujeres, su necesidad de una herramienta de detección eficaz es aún mayor. En la actualidad, las mujeres afectadas deben tomar la decisión de aceptar el mayor riesgo de un cáncer altamente letal o elegir olvidar (o terminar prematuramente) la maternidad. Esta es una decisión insoportablemente desafiante que enfrentan cientos de miles de mujeres solo en los EE. UU. En ciertos grupos étnicos, particularmente los judíos Ashkenazi, el riesgo de ser portador es de 1 en 40. Sin embargo, la mayoría de los portadores de BRCA, incluso aquellos que no se someten a cirugía, nunca desarrollarán HGSC. Existe una necesidad urgente de herramientas de diagnóstico de detección temprana en mujeres con alto riesgo de HGCS para salvar vidas y preservar la elección de la fertilidad. El producto de este objetivo será un conjunto de datos de biomarcadores de 115 pacientes que demuestre un rendimiento comercial sólido de dicho ensayo.

Objetivo 2A. Evaluar el rendimiento de la prueba de TP53 DS en UtLs para la detección de HGSC en pacientes de alto riesgo.

El patrocinador abordará este estudio según los métodos generales del Objetivo 1A. Una diferencia significativa es que UtL se recopilará de mujeres con HBOC que se someten a RRSO, en lugar de mujeres con masas ováricas conocidas. Después de la RRSO, los ovarios y las trompas de Falopio se someten a un meticuloso protocolo de corte conocido como SEE-FIM para examinar cuidadosamente los tejidos, en particular las fimbrias, en busca de STIC y cánceres ocultos. Entre esta población de alto riesgo, tales lesiones se encuentran en aproximadamente el 5% de las resecciones. El grupo de cáncer incluirá mujeres en las que se encontraron STIC o tumores ocultos durante SEE-FIM, el grupo de control incluirá mujeres sin lesiones. El diseño de este estudio es innovador porque se enfoca, no solo en mujeres de alto riesgo, sino específicamente en la capacidad de nuestro ensayo para detectar cánceres en etapas muy tempranas, potencialmente incluso microscópicos, cuando siguen siendo curables quirúrgicamente.

Métodos: Se analizarán muestras UtL de hasta 115 mujeres con síndromes hereditarios de cáncer de ovario de alto riesgo vía DS: 15 con STICs o cáncer oculto (casos) y hasta 100 libres de cáncer (controles). Los casos y controles se emparejarán por edad. Las UtL se realizarán inmediatamente antes de la RRSO. Las muestras quirúrgicas se evaluarán patológicamente mediante un protocolo SEE-FIM estandarizado de forma centralizada. Después de la RRSO, los ovarios y las trompas de Falopio se someten a un meticuloso protocolo de corte conocido como SEE-FIM para examinar cuidadosamente los tejidos, en particular las fimbrias, en busca de STIC y cánceres ocultos. El patrocinador espera haber identificado de 5 a 15 mujeres con STIC o cánceres ocultos en esta cohorte, 100 mujeres de la misma edad no tendrán lesiones detectadas. El menor número de casos de cáncer que de controles refleja el bajo porcentaje de cirugías con lesiones positivas y el número de muestra que el proyecto patrocinador puede lograr de manera realista. Aunque un número mayor sería óptimo, tales muestras son extremadamente limitadas. El grupo de cáncer incluirá mujeres en las que se encontraron STIC o HGSC ocultos durante SEE-FIM. El grupo de control incluirá mujeres sin lesiones. Análisis estadístico: Esto será según el Objetivo 1A.

Objetivo 2B. Calibración del umbral de diagnóstico en mujeres de alto riesgo por carga de mutación de fondo.

Este sub-objetivo utilizará el mismo protocolo y métodos estadísticos del objetivo 1B y los aplicará a la población de alto riesgo del Objetivo 2.

Métodos: Se evaluará el ADN de leucocitos de todos los casos de cáncer disponibles y un subconjunto de 30 mujeres elegidas al azar del grupo de control. Está bien establecido que el riesgo de malignidad en mujeres HBOC es elevado en relación con otras en virtud de defectos en la reparación del ADN que aumentan la probabilidad de que surjan mutaciones oncogénicas. Como tal, el patrocinador anticipa que la carga de mutación de fondo no derivada del cáncer medida en UtL y en sangre periférica también puede ser proporcionalmente elevada. El ajuste para la alta carga de mutación de fondo medida en la sangre puede ser particularmente importante para aumentar la especificidad en este grupo.

Análisis estadístico: Esto será según el Objetivo 1B.

OBJETIVO III Definir una firma de metilación para la detección de HGSC en UtLs. Durante los últimos 15 años, se ha demostrado el valor del análisis de metilación del ADN para la detección de cambios epigenéticos específicos de tumores, particularmente en el diagnóstico del cáncer. Los estudios de metilación del ADN en el cáncer de ovario (OC) se centraron en detectar fragmentos de ADN arrojados por las células OC al torrente sanguíneo (es decir, ADN libre de células - cfDNA) sugieren que los patrones de metilación del ADN en cfDNA tienen el potencial de detectar una proporción de OC hasta dos años antes del diagnóstico. Este estudio también muestra claramente la limitación de este enfoque porque solo se pudo detectar el 50% de todos los pacientes que finalmente desarrollaron cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSC) dentro de dos años. El problema subyacente es que, debido a la baja concentración de cfDNA en el torrente sanguíneo, es necesario detectar una señal muy débil. Con el objetivo de aumentar potencialmente la sensibilidad de la detección de HGSC, el patrocinador, en cooperación con el Prof. Andreas Weinhäusel, Instituto Austriaco de Tecnología (AIT), Unidad de Competencia de Diagnóstico Molecular, realizará un estudio de prueba de concepto en un subconjunto de pacientes incluidos en este proyecto. El Prof. Andreas Weinhäusel identificó 96 marcadores de metilación relevantes para HGSC. Solo se requiere una cantidad muy pequeña de ADN para la metilación del ADN. Por lo tanto, es recomendable utilizar el ADN ya disponible de los lavados y el tejido tumoral correspondiente, que se ha extraído en el curso de este estudio, para el desarrollo posterior de la especificidad y sensibilidad del procedimiento de prueba. El producto de AIM3 será un conjunto de datos de marcadores de metilación de 140 pacientes que demuestra un rendimiento de alta sensibilidad de dicho ensayo.

Métodos: El ADN genómico de UtL y el tejido tumoral correspondiente de 30 pacientes con HGSC y 10 STIC/cánceres ocultos se enriquecerán en ADN metilado con la ayuda de enzimas de restricción sensibles a la metilación. Este ADN se analizará realizando una qPCR de alto rendimiento en la que se analizarán en paralelo 5 x 96 marcadores x 96 ADN. Los marcadores más informativos se combinarán con una firma de metilación. Para probar la especificidad del ADN de la firma de UtLs de 60 controles se analizarán (30 casos de riesgo medio y 30 casos de alto riesgo). La evaluación del patrón de metilación del ADN se realizará en los lavados previos a la resección y en hasta 10 lesiones STIC/cánceres ocultos. Cuando los resultados de la patología local identifiquen STIC o células cancerosas ocultas (tejido FFPE), se realizará microdisección con láser y aislamiento de ADN. Posteriormente, se aplicará la secuenciación NGS TP53 estándar como se describe en AIM 1 y AIM 2. En este subestudio piloto, se aplicará qPCR de alto rendimiento al material de ADN restante para evaluar el estado de metilación.

Análisis estadístico: con el objetivo de evaluar el potencial para definir una firma de metilación de ADN para pruebas de PCR simples, los valores de dCT-PCR del análisis MSREqPCR de alto rendimiento de 96 plexos serán analizados por bioinformática y bioestadística para realizar 1) comparación de clases entre los datos clínicos relevantes subtipos y clases para definir genes significativamente metilados diferencialmente; 2) análisis de predicción de clase multivariable utilizando diferentes enfoques de selección de características basados ​​en valores p de marcador único. Diferentes algoritmos de clasificación (p. k-vecino más cercano, máquinas de vectores de soporte, análisis de discriminación lineal, etc.), utilizando validación cruzada de 10 veces y/o validación cruzada de exclusión para seleccionar los mejores marcadores de metilación candidatos y algoritmos; además, los valores de AUC superiores de los marcadores de metilación candidatos únicos se definirán en el análisis ROC y se considerarán para la selección de marcadores.

Se seleccionará un subconjunto de 48 marcadores candidatos para su confirmación en un conjunto de muestras separado. Los datos de metilación derivados de los mismos se analizarán mediante comparación de clases y análisis de predicción de clases de manera similar al primer conjunto de datos derivados del análisis 480plex. Se definirán los mejores marcadores individuales y combinaciones de marcadores del análisis multivariante. Los resultados de la clasificación y los datos de metilación se compararán con los resultados de la prueba de mutación de p53 para evaluar el potencial de la clasificación diagnóstica basada en la metilación, solo y en combinación con el análisis de mutación de p53. Esto se llevará a cabo aplicando diferentes enfoques de predicción de clases que integren datos de p53 y de metilación en modelos multivariados.