Früherkennung von hochgradigem Eierstockkrebs mittels Uteruslavage-EHUD-Studie und Duplex-Sequenzierung (EHUD)

ANSATZPHASE I Die University of Washington hat den diagnostischen Proof of Principle demonstriert; Für den Einsatz im industriellen Maßstab ist jedoch eine weitere Optimierung und Validierung erforderlich. In Phase I wird die UtL-Filtrationsmethode optimiert (Ziel 1), die analytische Leistung im kommerziellen Arbeitsablauf validiert (Ziel 2) und ein Meilenstein bei der Probennahme erreicht (Ziel 3). Ziel 1. Bestimmung des Nutzens der Uterusspülungsfiltration zur Maximierung der Anreicherung von tumorabgeleiteter DNA. Vorläufige Tests mit zwei Proben zeigten, dass die Filtration von UtLs zur Entfernung von Ansammlungen von Endometriumzellen die Empfindlichkeit für Tumormutationen um ein Vielfaches erhöhen könnte. Dieser Datensatz wird durch die Analyse des Filtereffekts in 10 UtLs von Patienten mit HGSC mit bekannten TP53-Mutationen erweitert. Jede UtL wird in zwei Hälften geteilt: Die erste Hälfte wird gefiltert und die zweite bleibt ungefiltert. DNA wird aus den filtrierten, filtrierten und unfiltrierten Fraktionen extrahiert und mit TP53 DS analysiert (insgesamt 30 Proben). Für jede UtL werden die DNA-Ausbeute in jeder der Fraktionen und die MAF der Tumormutation verglichen. Es wird erwartet, dass die gefilterte Fraktion weniger DNA enthält als die ungefilterte Fraktion, aber die Tumormutation wird häufiger vorhanden sein. Wenn die Sensitivität verbessert wird (d. h. durch die Anreicherung wird mehr gewonnen als durch die Reduktion von weniger verfügbarer DNA verloren geht), wird bei allen künftig gesammelten Proben filtriert. Ziel 2. Validierung des optimierten Assays: Genauigkeit, Präzision, Nachweisgrenze und Reproduzierbarkeit. TwinStrand hat einen optimierten DS-Arbeitsablauf mit verbesserten Adaptern, Ligationschemie und einem 96-Well-Platten-basierten Format mit hohem Durchsatz entwickelt, das für Liquid-Handling-Roboter geeignet und mit den CLIA-Laborstandards kompatibel ist.

TwinStrand hat außerdem eine optimierte Cloud-basierte Analysepipeline entwickelt, die die automatisierte parallele Verarbeitung mehrerer Proben unterstützt. Das optimierte Verfahren zum Nachweis von TP53-Mutationen in UtL-Proben wird validiert. Um Genauigkeit, technische Präzision und untere Nachweisgrenze zu beurteilen, werden DNA-Proben von zwei Personen, die sich im Genotyp an >5 SNP-Stellen in oder in der Nähe von TP53 unterscheiden, in Verhältnissen von 1:100 bis 1:5.000, zwei UtL, gemischt. Die Mischungen werden in zwei unabhängigen Experimenten mit einer ~10.000-fachen molekularen Tiefe sequenziert. Die SNP-Allelfraktion (AF) wird bei verschiedenen Verdünnungen verglichen, um die Genauigkeit (erwarteter AF vs. beobachteter AF), die Präzision (AF-Variation zwischen Replikaten) und die niedrigste erreichbare Nachweisgrenze zu bestimmen. Um die Reproduzierbarkeit des Assays in seiner beabsichtigten klinischen Verwendung zu testen, wird die Sequenzierung an den 30 Proben wiederholt, die für Ziel 1 verwendet werden, was eine breite Palette von Tumor-MAFs umfassen wird. Der Sponsor berechnet den Variationskoeffizienten zwischen Replikaten. Basierend auf Pilotstudien erwartet der Sponsor eine hervorragende Reproduzierbarkeit (VK <5 %). Ziel 3. Probenahme. Die Entnahme der in Phase II vorgeschlagenen Proben wird nach entsprechender Genehmigung des IRB/Ethikausschusses an jeder teilnehmenden Institution begonnen.

Nach der Entnahme werden die Proben an das Institut für Krebsforschung der Medizinischen Universität Wien versandt, das die UtL-Filtration und DNA-Extraktion durchführt.

Gepaarte DNA aus Pap-Abstrichen und peripheren Leukozyten wird ebenfalls extrahiert. Isolierten DNAs wird eine Identifikationsnummer zugewiesen und sie werden zur Duplex-Sequenzierung an TwinStrand versandt.

Meilensteine ​​der Phase I:

1. Bestätigen Sie die Nützlichkeit der UtL-Filtration bei der Anreicherung von Tumormutationen.
2. Quantifizieren Sie die Genauigkeit, Präzision, untere Nachweisgrenze und Reproduzierbarkeit des optimierten Assays auf UtLs.
3. Beginnen Sie mit der Probenentnahme für Phase II.

Produkte der Phase I:

1. DS-Workflow bereit zur Anwendung auf UtL-DNA im kommerziellen Maßstab in Phase II und Phase III.
2. Sample-Bank für Phase II

ANSATZ PHASE II Phase II wird die Verwendung von TP53 DS auf UtLs zur Früherkennung von Eierstockkrebs in erweiterten Fallkontroll-Patientenkohorten validieren, die sowohl durchschnittliche als auch Hochrisikopopulationen umfassen. Vordefinierte Parameter, die die Sensitivität und Spezifität der TP53-Mutationshäufigkeit beeinflussen können, werden untersucht und statistisch modelliert. Klinische Sensitivität und Spezifität werden maximiert, indem personalisierte statistische Modelle für diagnostische Schwellenwerte unter Verwendung multivariater klinischer Merkmale sowie der einzigartigen Hintergrundmutationslast jedes Individuums basierend auf der Leukozytensequenzierung erstellt werden. Bei einer Untergruppe von Patienten wird die überlegene Leistung von UtL gegenüber Pap-Abstrichen bestätigt. Darüber hinaus wird eine Proof-of-Concept-Studie an einer Untergruppe der eingeschlossenen Patienten durchgeführt, um eine Reihe von 96 Methylierungsmarkern zu untersuchen, die für HGSC in UtLs und entsprechendem Tumorgewebe/STICs relevant sind.

ZIEL 1. ALLGEMEINE BEVÖLKERUNG OVARIANISCHES KREBS-SCREENING Dieses Ziel wird einen Biomarker für den HGSC-Nachweis in einer durchschnittlichen Risikopopulation entwickeln. Der Sponsor wird eine Fall-Kontroll-Studie durchführen, die TP53 DS-Mutationsdaten mit klinischen pathologischen Informationen integriert, um Frauen mit HGSC mit maximaler Sensitivität und Spezifität zu identifizieren. Mehr als 98 % der HGSCs tragen Mutationen in TP53, was bedeutet, dass ultratiefe DS kostengünstig auf nur eine kleine genomische Region konzentriert werden kann. Das Ergebnis dieses Ziels wird ein Biomarker-Datensatz von 200 Patientinnen sein, der die kosteneffiziente, kommerziell robuste Leistung dieser dringend benötigten Diagnostik für Eierstockkrebs demonstriert.

Ziel 1A: Bewertung der Testleistung von TP53 DS auf UtLs für den HGSC-Nachweis bei Patienten mit durchschnittlichem Risiko.

Methoden: UtL-Proben von 200 Probanden aus der durchschnittlichen Risikopopulation werden mittels DS analysiert: 100 Probanden mit HGSC (Fälle) und 100 Probanden mit Läsionen, die nach der Resektion letztendlich als gutartig befunden wurden, d. h. ohne Krebs (Kontrollen). Bei allen Patienten wird UtL vor einem chirurgischen Eingriff für eine ovarielle Masse gesammelt. Die Lavage wird während der Lutealphase des Menstruationszyklus durchgeführt, falls prämenopausal. Chirurgische Proben werden pathologisch beurteilt, und ein Patient wird abhängig von den histologischen Ergebnissen als HGSC-positiv oder als Kontrolle gezählt. Bei Krebspatienten wird der Primärtumor mit konventionellen Methoden von der Medizinischen Universität Wien auf ein Panel von Genen sequenziert, das TP53, BRCA1 und BRCA2 umfasst. Für alle nicht identifizierten Patientenproben umfassen die gesammelten klinischen Informationen: Alter, Rauchergeschichte, frühere Chemotherapie-Exposition, Parität, Alter der Menopause, Alter der Menarche, Vorgeschichte der Einnahme von oralen Kontrazeptiva, Krebs-Familiengeschichte und sieben- Genmutationsstatus des Primärtumors. Fälle und Kontrollen werden altersangepasst und es wird eine möglichst breite Altersspanne eingeschlossen, um die Wirkung des Alters auf Sensitivität und Spezifität zu beurteilen.

Statistische Analyse: Aus den Ausgabedateien der Duplex-Sequenzierung wird ein detailliertes Mutationsprofil für jede Probe erstellt, einschließlich: Mutantenallelhäufigkeit (MAF) für alle mutierten Positionen, Mutationsspektrum, vorhergesagte Pathogenität für die Proteinfunktion, Beziehung zu bekannten Hotspots und Gesamtmutationslast (Anzahl mutanter Nukleotide dividiert durch die Gesamtzahl sequenzierter Nukleotide). Anschließend werden die Proben für den Fallkontrollstatus entblindet. TP53 MAF aus von UtLs gesammelter DNA wird als Prädiktor für die Unterscheidung zwischen Patienten mit durchschnittlichem Risiko (AIM I) mit und ohne HGSC durch logistische Regressionsmodellierung verwendet. Alter, Raucheranamnese, frühere Chemotherapieexposition, Parität, Alter der Menopause, Alter der Menarche, orale Kontrazeptiva in der Anamnese, familiäre Krebsanamnese und Keimbahn-Mutationsstatus werden als mögliche Confounder betrachtet. Die Modellvorhersage wird durch Kreuzvalidierung bewertet. Eine analoge Analyse wird auf die Gruppe der Hochrisikopatienten (AIM II) angewendet, bei der das Vorhandensein und Fehlen von STIC die Ergebnisvariable definiert. In beiden Fällen werden Grenzwerte für die Mutantenallelhäufigkeit vorgeschlagen und die Spezifität und Sensitivität einschließlich geeigneter Konfidenzintervalle geschätzt.

Ziel 1B: Verbesserung der diagnostischen Leistung durch personalisierte Kalibrierung durch Hintergrundmutationslast.

Die beispiellose Empfindlichkeit von DS führte uns und andere zu der neuartigen Entdeckung, dass sich krebsähnliche Mutationen mit zunehmendem Alter in sehr geringen Mengen in mehreren menschlichen Geweben anhäufen. In einer Pilotstudie entdeckte der Sponsor, dass die durchschnittliche BB-Mutationslast in UtLs etwas höher ist als in anderen Geweben, möglicherweise aufgrund des DNA-Beitrags aus Endometriumgewebe, das sich vor der Menopause extensiv repliziert. Während dies die Spezifität in der Pilotstudie nicht beeinträchtigte, erkannte der Sponsor, dass BB bei einigen sehr frühen Tumoren, bei denen das MAF-Signal niedrig ist, oder bei sehr alten Frauen, bei denen der Hintergrund hoch ist, ein Hindernis darstellen könnte. Der Sponsor geht davon aus, dass die Lavage-Filtration und die Gewinnung der Lutealphase bei prämenopausalen Frauen das BB-Signal reduzieren, aber als zusätzliche Maßnahme wird der Sponsor prüfen, ob die Leistung durch Normalisierung für die Hintergrundmutationslast einer Person weiter verbessert werden kann. Der Sponsor stellt die Hypothese auf, dass das Niveau der TP53-Mutationen in zirkulierenden Leukozyten als empirisch gemessener persönlicher Kalibrator dienen kann, der nicht nur bekannte Faktoren erfasst, die den BB erhöhen, wie das Alter, sondern auch unbekannte mutagene Expositionen oder andere Faktoren, die während des Lebens einer Person auftreten. Obwohl DNA aus Leukozyten wahrscheinlich nur eine minimale Menge zum Gesamtpool von BB-Mutationen in UtLs beiträgt, postuliert der Sponsor, dass sie als sprichwörtlicher „Kanarienvogel in einer Kohlenmine“ dienen könnten, der proportional repräsentativ für BB-Mutationen anderswo im Körper sein wird. Die BB-Mutationslast in einer Lavage selbst kann in einer realen Umgebung nicht direkt gemessen werden, wenn die von einem Tumor beigetragene(n) Mutation(en) unbekannt sind. Die Plausibilität dieses Konzepts wurde durch unsere anfängliche Studie zu TP53-Mutationen in Peritonealflüssigkeit gezeigt, die eine Teilmenge übereinstimmender Blutproben umfasste und auf eine starke Assoziation zwischen BB und Alter hinwies.

Methoden: DNA aus der Komponente peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) – gesammelt unmittelbar vor einer Operation – von zufällig ausgewählten 50 von 100 HGSC-Fällen und 50 von 100 Kontrollen aus Ziel 1A wird extrahiert und TP53 DS bei ~10.000x molekular unterzogen Tiefe. TP53-Mutationen von PBMCs werden von den im UtL gefundenen TP53-Mutationen abgezogen.

Statistische Analyse: Der Sponsor wird den Zusammenhang zwischen TP53-Mutationshäufigkeiten in UtL und Leukozyten untersuchen und feststellen, ob falsch negative Ergebnisse in Ziel 1A Fällen mit erhöhtem BB in Leukozyten entsprechen. Darüber hinaus analysiert der Sponsor die TP53-Mutationshäufigkeiten in Leukozyten als Prädiktor für den Fallkontrollstatus, wiederum unter Verwendung des 10-%-Auslassungsverfahrens. Diese innovative Kalibrierungsmethode wird mit den einfachen ROC-Metriken verglichen, die mit dem univariaten Modell unter Verwendung eines festen Mutationsanteils sowie dem angepassten multivariaten Modell, das auf der Grundlage anderer Patientenmerkmale wie Alter entwickelt wurde, erreicht werden. Da es sich um eine wissenschaftliche Frage handelt, die mit den vorliegenden Zielen nichts zu tun hat, ist der Sponsor gespannt, ob die Leukozyten-TP53-Mutationslast als unabhängiger Prädiktor für das Patientenalter, den allgemeinen Gesundheitszustand oder die Vorgeschichte mutagener Expositionen dienen wird.

Ziel 1C. Vergleich der diagnostischen Leistungsfähigkeit der Uterusspülung mit der DNA aus dem Pap-Abstrich.

Der erste Bericht über die Verwendung von NGS zur Erkennung von Eierstockkrebs aus einer transvaginalen Flüssigkeitsbiopsie stützte sich auf die Entnahme von Pap-Abstrichen und SafeSeqS als Sequenzierungstechnologie. Die genannte Sensitivität von 41 % lieferte einen wichtigen Grundsatzbeweis, aber auch reichlich Raum für Verbesserungen. Der Sponsor hat die überlegene Genauigkeit von DS gegenüber SafeSeqS-ähnlichen Methoden eindeutig nachgewiesen, und laufende Studien in unserem Labor weisen auf eine begrenzte Empfindlichkeit von Pap-Abstrichen im Vergleich zu UtL hin. Ein direkter Vergleich der beiden Erhebungsmethoden an denselben Patienten steht jedoch noch aus. Der formelle Nachweis der Überlegenheit von UtL gegenüber Pap-Abstrichen wird beim kommerziellen Markteintritt helfen (der Sponsor weist darauf hin, dass PapGene Inc, einem Unternehmen, das von den Autoren der oben genannten Studie gegründet wurde, ein verwandtes NCI SBIR zuerkannt wurde). Die Überlegenheit von UtL wird aufgrund der Tatsache erwartet, dass die Lavagen die Eileiter und Eierstockoberflächen erreichen, während Pap-Abstriche darauf beruhen, dass disseminierte Krebszellen den Zervikalkanal erreichen. Für den Fall, dass TP53 DS auf Pap-Abstrichen nicht drastisch schlechter als UtL abschneidet, würde der Sponsor diese ergänzende Sammelmethode weiter untersuchen. Da Pap-Abstriche routinemäßig von Hausärzten durchgeführt werden, könnte die Möglichkeit, diese zu verwenden, dazu beitragen, die Marktakzeptanz zu beschleunigen. Aktuelle Beweise weisen jedoch auf die wahrscheinliche Unterlegenheit von Pap-Abstrichen hin.

Methoden: Der Sponsor wird TP53 DS wie oben durchführen, jedoch unter Verwendung von DNA aus Pap-Abstrichen, die vor der Operation einer zufällig ausgewählten, altersangepassten Untergruppe von 25 Krebsfällen und 25 Kontrollen aus Ziel 1A entnommen wurden.

Statistische Analyse: Daten zu TP53 MAF aus DNA, die durch herkömmliche Pap-Abstrich-Tests von einer Teilstichprobe von Patienten mit durchschnittlichem Risiko gesammelt wurden, werden als zusätzlicher Prädiktor in Modellen betrachtet, die innerhalb der Ziele 1A und 1B entwickelt wurden. Der Sponsor wird untersuchen, ob es zusätzliche Möglichkeiten gibt, Fälle von Kontrollen zu unterscheiden kann durch Kombinieren von Informationen aus Pap-Abstrichen und UtLs gewonnen werden.

ZIEL 2. HOCHRISIKOBEVÖLKERUNG AUF EIERKREBS-SCREENING Dieses Ziel verfolgt einen ähnlichen Ansatz wie Ziel 1, konzentriert sich jedoch auf Frauen mit einem hohen Risiko für Eierstockkrebs aufgrund erblicher Mutationen von Brust- und Eierstockkrebs (HBOC). HBOC-Frauen wurden durch eine starke Familienanamnese von Brust- oder Eierstockkrebs identifiziert und es wurde festgestellt, dass sie Mutationen in Krebsanfälligkeitsgenen tragen, normalerweise BRCA1 und BRCA2, die ein lebenslanges HGSC-Risiko von 35%, 46% und 13%, 23% verleihen. bzw. Behandlungsstandard ist die risikomindernde Salpingo-Oophorektomie (RRSO) in einem frühen Alter, typischerweise nach Abschluss der Geburt. Obwohl dieser Ansatz die Sterblichkeit senkt, ist er unvollkommen: Etwa 10 % der Eierstockkrebse in dieser Population entwickeln sich vor dem 40. Lebensjahr. In der Wiener Fallserie wurden Krebserkrankungen bereits im Alter von 20 Jahren beobachtet, also lange bevor eine prophylaktische Operation normalerweise durchgeführt worden wäre. Daher haben HBOC-Frauen in ihren gebärfähigen Jahren selbst bei Standardbehandlung ein deutlich erhöhtes Risiko für Eierstockkrebs im Vergleich zu anderen Frauen, und ihr Bedarf an einem wirksamen Screening-Instrument ist sogar noch größer. Derzeit müssen betroffene Frauen die Entscheidung treffen, entweder das erhöhte Risiko einer hochtödlichen Krebserkrankung in Kauf zu nehmen oder die Geburt zu vergessen (oder vorzeitig zu beenden). Dies ist eine entsetzlich herausfordernde Entscheidung, vor der Hunderttausende von Frauen allein in den USA stehen. In bestimmten ethnischen Gruppen, insbesondere bei aschkenasischen Juden, liegt das Risiko, Träger zu sein, bei 1 zu 40. Doch die Mehrheit der BRCA-Trägerinnen, selbst diejenigen, die sich keiner Operation unterziehen, wird niemals HGSC entwickeln. Es besteht ein dringender Bedarf an diagnostischen Früherkennungsinstrumenten bei Frauen mit hohem HGCS-Risiko, um Leben zu retten und die Wahl der Fruchtbarkeit zu erhalten. Das Produkt dieses Ziels wird ein Biomarker-Datensatz von 115 Patienten sein, der die kommerziell robuste Leistung eines solchen Assays demonstriert.

Ziel 2A. Bewertung der Testleistung von TP53 DS auf UtLs für den HGSC-Nachweis bei Hochrisikopatienten.

Der Sponsor wird diese Studie gemäß den allgemeinen Methoden von Ziel 1A angehen. Ein signifikanter Unterschied besteht darin, dass UtL von HBOC-Frauen gesammelt wird, die sich einer RRSO unterziehen, und nicht von Frauen mit bekannten ovariellen Raumforderungen. Nach RRSO werden die Eierstöcke und Eileiter einem sorgfältigen Schnittprotokoll unterzogen, das als SEE-FIM bekannt ist, um das Gewebe, insbesondere die Fimbrien, sorgfältig auf STICs und okkulte Krebsarten zu untersuchen. Bei dieser Hochrisikopopulation werden solche Läsionen bei etwa 5 % der Resektionen gefunden. Die Krebsgruppe umfasst Frauen, bei denen STICs oder okkulte Tumore während der SEE-FIM gefunden wurden, die Kontrollgruppe umfasst Frauen ohne Läsionen. Dieses Studiendesign ist insofern innovativ, als es sich nicht nur auf Frauen mit hohem Risiko konzentriert, sondern insbesondere auf die Fähigkeit unseres Assays, Krebs in sehr frühen Stadien, möglicherweise sogar mikroskopisch, zu erkennen, wenn sie chirurgisch heilbar bleiben.

Methoden: UtL-Proben von bis zu 115 Frauen mit erblichen Hochrisiko-Eierstockkrebs-Syndromen werden mittels DS analysiert: 15 mit STICs oder okkultem Krebs (Fälle) und bis zu 100 krebsfrei (Kontrollen). Fall und Kontrolle werden nach Alter abgeglichen. UtLs werden unmittelbar vor RRSO durchgeführt. Chirurgische Proben werden durch ein zentral standardisiertes SEE-FIM-Protokoll pathologisch bewertet. Nach RRSO werden die Eierstöcke und Eileiter einem sorgfältigen Schnittprotokoll unterzogen, das als SEE-FIM bekannt ist, um das Gewebe, insbesondere die Fimbrien, sorgfältig auf STICs und okkulte Krebsarten zu untersuchen. Der Sponsor geht davon aus, 5 bis 15 Frauen mit STIC oder okkultem Krebs in dieser Kohorte identifiziert zu haben, 100 gleichaltrige Frauen werden keine erkannten Läsionen aufweisen. Die geringere Anzahl an Krebsfällen als bei den Kontrollen spiegelt den geringen Prozentsatz an Operationen mit positiven Läsionen und die Stichprobenzahl wider, die das Sponsorprojekt realistischerweise erreichen kann. Obwohl eine größere Anzahl optimal wäre, sind solche Proben äußerst begrenzt. Die Krebsgruppe umfasst Frauen, bei denen STICs oder okkulte HGSC während der SEE-FIM gefunden wurden. Die Kontrollgruppe umfasst Frauen ohne Läsionen. Statistische Analyse: Dies entspricht Ziel 1A.

Ziel 2B. Diagnostische Schwellenkalibrierung bei Frauen mit hohem Risiko durch Hintergrundmutationslast.

Dieses Teilziel wird dasselbe Protokoll und dieselben statistischen Methoden wie Ziel 1B verwenden und sie auf die Hochrisikopopulation von Ziel 2 anwenden.

Methoden: Leukozyten-DNA aus allen verfügbaren Krebsfällen und einer zufällig ausgewählten Untergruppe von 30 Frauen der Kontrollgruppe wird ausgewertet. Es ist allgemein bekannt, dass das Malignitätsrisiko bei HBOC-Frauen aufgrund von Defekten in der DNA-Reparatur, die die Wahrscheinlichkeit des Auftretens onkogener Mutationen erhöhen, im Vergleich zu anderen erhöht ist. Daher geht der Sponsor davon aus, dass die nicht krebsbedingte Hintergrundmutationslast, gemessen in UtLs sowie im peripheren Blut, ebenfalls proportional erhöht sein kann. Die Anpassung an die im Blut gemessene hohe Hintergrundmutationslast kann besonders wichtig sein, um die Spezifität in dieser Gruppe zu erhöhen.

Statistische Analyse: Diese erfolgt gemäß Ziel 1B.

AIM III Definieren einer Methylierungssignatur für den HGSC-Nachweis in UtLs. In den letzten 15 Jahren wurde der Wert der DNA-Methylierungsanalyse zum Nachweis epigenetischer, tumorspezifischer Veränderungen insbesondere in der Krebsdiagnostik nachgewiesen. Studien zur DNA-Methylierung bei Eierstockkrebs (OC) konzentrierten sich auf den Nachweis von DNA-Fragmenten, die von OC-Zellen in den Blutkreislauf abgegeben werden (d. h. zellfreie DNA - cfDNA) legen nahe, dass DNA-Methylierungsmuster in cfDNA das Potenzial haben, einen Teil der OCs bis zu zwei Jahre vor der Diagnose zu erkennen. Diese Studie zeigt auch deutlich die Limitation dieses Ansatzes, da nur 50 % aller Patientinnen, die innerhalb von zwei Jahren schließlich ein hochgradiges seröses Ovarialkarzinom (HGSC) entwickelten, erkannt werden konnten. Das zugrunde liegende Problem besteht darin, dass aufgrund der geringen Konzentration von cfDNA im Blutstrom ein sehr schwaches Signal detektiert werden muss. Mit dem Ziel, die Sensitivität des HGSC-Nachweises potenziell zu erhöhen, wird der Sponsor in Zusammenarbeit mit Prof. Andreas Weinhäusel, Austrian Institute of Technology (AIT), Competence Unit Molecular Diagnostics, eine Proof-of-Concept-Studie in einer Untergruppe von eingeschlossenen Patienten durchführen dieses Projekt. Prof. Andreas Weinhäusel identifizierte 96 für HGSC relevante Methylierungsmarker. Für die DNA-Methylierung wird nur eine sehr geringe DNA-Menge benötigt. Es empfiehlt sich daher, die bereits verfügbare DNA aus den Lavagen und dem entsprechenden Tumorgewebe, die im Zuge dieser Studie gewonnen wurde, für die Weiterentwicklung der Spezifität und Sensitivität des Testverfahrens zu nutzen. Das Produkt von AIM3 wird ein Datensatz mit Methylierungsmarkern von 140 Patienten sein, der die hochempfindliche Leistung eines solchen Assays demonstriert.

Methoden: Genomische DNA von UtLs und entsprechendem Tumorgewebe von 30 HGSC-Patienten und 10 STICs/okkulten Krebserkrankungen wird mit Hilfe von methylierungssensitiven Restriktionsenzymen auf methylierte DNA angereichert. Diese DNA wird analysiert, indem eine Put-qPCR im Hochdurchsatz durchgeführt wird, bei der 5 x 96 Marker x 96 DNA parallel analysiert werden. Die aussagekräftigsten Marker werden zu einer Methylierungssignatur kombiniert. Um die Spezifität der Signatur-DNA von UtLs aus 60 Kontrollen zu beweisen, werden sie analysiert (30 Fälle mit mittlerem Risiko und 30 Fälle mit hohem Risiko). Die Bewertung des DNA-Methylierungsmusters wird an den Lavagen vor der Resektion und an bis zu 10 STIC-Läsionen/okkulten Krebsarten durchgeführt. Wenn lokale pathologische Ergebnisse STICs oder okkulte Krebszellen (FFPE-Gewebe) identifizieren, wird eine Lasermikrodissektion und DNA-Isolierung durchgeführt. Anschließend wird eine standardmäßige NGS TP53-Sequenzierung durchgeführt, wie in AIM 1 und AIM 2 beschrieben. In dieser Pilot-Unterstudie wird Hochdurchsatz-qPCR auf verbleibendes DNA-Material zur Bewertung des Methylierungsstatus angewendet.

Statistische Analyse: Mit dem Ziel, das Potenzial zur Definition einer DNA-Methylierungssignatur für einfache PCR-Tests zu bewerten, werden dCT-PCR-Werte aus 96-Plex-Hochdurchsatz-MSREqPCR-Analysen durch Bioinformatik und Biostatistik analysiert, um einen 1) Klassenvergleich zwischen den relevanten klinischen Tests durchzuführen Subtypen und Klassen zur Definition signifikant unterschiedlich methylierter Gene; 2) Multivariate Klassenvorhersageanalyse unter Verwendung verschiedener Merkmalsauswahlansätze basierend auf Einzelmarker-p-Werten. Verschiedene Klassifikationsalgorithmen (z.B. k-nächster Nachbar, Support-Vektor-Maschinen, lineare Diskriminationsanalysen usw.) werden unter Verwendung einer 10-fachen Kreuzvalidierung und/oder einer Auslassungs-Kreuzvalidierung zur Auswahl der besten Kandidaten für Methylierungsmarker – und Algorithmen – angewendet; Darüber hinaus werden die Top-AUC-Werte einzelner Kandidaten für Methylierungsmarker in der ROC-Analyse definiert und für die Markerauswahl berücksichtigt.

Eine Teilmenge von 48 Kandidatenmarkern wird zur Bestätigung in einem separaten Probensatz ausgewählt. Die daraus abgeleiteten Methylierungsdaten werden unter Verwendung von Klassenvergleich und Klassenvorhersageanalyse in ähnlicher Weise wie der erste Datensatz, der aus der 480-Plexed-Analyse abgeleitet wurde, analysiert. Es werden die leistungsstärksten Einzelmarker und Kombinationen von Markern aus der multivariaten Analyse definiert. Klassifikationsergebnisse und Methylierungsdaten werden mit p53-Mutationstestergebnissen verglichen, um das Potenzial einer methylierungsbasierten diagnostischen Klassifikation allein und in Kombination mit einer p53-Mutationsanalyse zu bewerten. Dies wird unter Anwendung verschiedener Klassenvorhersageansätze durchgeführt, wobei sowohl p53- als auch Methylierungsdaten in multivariate Modelle integriert werden.