Détection précoce du cancer de l'ovaire de haut grade à l'aide de l'étude EHUD de lavage utérin et du séquençage duplex (EHUD)

APPROCHE PHASE I L'Université de Washington a démontré la preuve diagnostique de principe; cependant, une optimisation et une validation supplémentaires sont nécessaires pour un déploiement à l'échelle industrielle. Dans la phase I, la méthode de filtration UtL sera optimisée (objectif 1), les performances analytiques sur le flux de travail commercial validées (objectif 2) et une étape de collecte d'échantillons atteinte (objectif 3). Objectif 1. Déterminer l'utilité de la filtration du lavage utérin pour maximiser l'enrichissement en ADN dérivé de la tumeur. Des tests préliminaires avec deux échantillons ont indiqué que la filtration des UtL pour éliminer les grappes de cellules endométriales pourrait augmenter de plusieurs fois la sensibilité aux mutations tumorales. Cet ensemble de données sera élargi en analysant l'effet de filtration dans 10 UtL de patients atteints de HGSC avec des mutations TP53 connues. Chaque UtL sera divisé en deux : la première moitié sera filtrée et la seconde restera non filtrée. L'ADN sera extrait des fractions filtrées, filtrées et non filtrées et analysé par TP53 DS (total de 30 échantillons). Pour chaque UtL, le rendement en ADN dans chacune des fractions et le MAF de la mutation tumorale seront comparés. Il est prévu que la fraction filtrée contiendra moins d'ADN que la fraction non filtrée, mais la mutation tumorale sera présente à une fréquence plus élevée. Si la sensibilité est améliorée (c'est-à-dire que l'on gagne plus par enrichissement que ce qui est perdu par réduction à partir d'un ADN moins disponible), la filtration sera utilisée sur tous les futurs échantillons collectés. Objectif 2. Validation du test optimisé : exactitude, précision, limite de détection et reproductibilité. TwinStrand a développé un flux de travail DS rationalisé en utilisant des adaptateurs améliorés, une chimie de ligature et un format de plaque à 96 puits à haut débit adapté aux robots de manipulation de liquides et compatible avec les normes de laboratoire CLIA.

TwinStrand a également développé un pipeline d'analyse optimisé basé sur le cloud qui prend en charge le traitement parallèle automatisé de plusieurs échantillons. Le procédé optimisé pour la détection des mutations TP53 dans les échantillons UtL sera validé. Pour évaluer l'exactitude, la précision technique et la limite inférieure de détection, des échantillons d'ADN de deux individus dont le génotype diffère à > 5 sites SNP dans ou près de TP53 seront mélangés, dans des rapports de 1:100 à 1:5 000, deux UtL. Les mélanges seront séquencés à une profondeur moléculaire d'environ 10 000x dans deux expériences indépendantes. La fraction d'allèles SNP (FA) sera comparée à différentes dilutions pour déterminer l'exactitude (FA attendue par rapport à la FA observée), la précision (variation de la FA parmi les répétitions) et la limite de détection la plus basse réalisable. Pour tester la reproductibilité du test dans son utilisation clinique prévue, le séquençage sera répété sur les 30 échantillons utilisés Objectif 1, qui englobera un large éventail de MAF tumoraux. Le commanditaire calculera le coefficient de variation entre les répétitions. Sur la base d'études pilotes, le promoteur anticipe une excellente reproductibilité (CV<5%). Objectif 3. Collecte d'échantillons. La collecte des échantillons proposés dans la phase II commencera sous réserve de l'approbation appropriée du comité d'éthique/comité d'éthique de chaque établissement participant.

Après la collecte, les échantillons sont expédiés à l'Institut de recherche sur le cancer de l'Université de médecine de Vienne, qui effectuera une filtration UtL et une extraction d'ADN.

L'ADN apparié des frottis Pap et des leucocytes périphériques sera également extrait. Les ADN isolés se verront attribuer un numéro d'identification et seront expédiés à TwinStrand pour le séquençage duplex.

Jalons de la phase I :

1. Confirmer l'utilité de la filtration UtL sur l'enrichissement des mutations tumorales.
2. Quantifiez l'exactitude, la précision, la limite inférieure de détection et la reproductibilité des tests rationalisés sur les UtL.
3. Commencer la collecte d'échantillons pour la Phase II.

Produits de phase I :

1. Flux de travail DS prêt à être appliqué à UtL DNA à l'échelle commerciale en Phase II et Phase III.
2. Banque d'échantillons pour la phase II

APPROCHE PHASE II La phase II validera l'utilisation du TP53 DS sur les UtL pour la détection précoce du cancer de l'ovaire dans des cohortes élargies de patients témoins comprenant à la fois des populations à risque moyen et élevé. Les paramètres prédéfinis qui peuvent affecter la sensibilité et la spécificité de la fréquence des mutations TP53 seront examinés et modélisés statistiquement. La sensibilité et la spécificité cliniques seront maximisées en créant des modèles statistiques de seuil de diagnostic personnalisés utilisant des caractéristiques cliniques multivariées, ainsi que la charge de mutation de fond unique de chaque individu basée sur le séquençage des leucocytes. Dans un sous-ensemble de patients, la performance supérieure de l'UtL par rapport à l'échantillonnage du frottis Pap sera confirmée. De plus, une étude de preuve de concept sera menée dans un sous-ensemble de patients inclus pour étudier un ensemble de 96 marqueurs de méthylation pertinents pour les HGSC dans les UtL et les tissus tumoraux/STIC correspondants.

OBJECTIF 1. DÉPISTAGE DU CANCER DE L'OVAIRE EN POPULATION GÉNÉRALE Cet objectif vise à développer un biomarqueur pour la détection des HGSC dans une population à risque moyen. Le commanditaire mènera une étude cas-témoins qui intègre les données mutationnelles du TP53 DS aux informations pathologiques cliniques afin d'identifier les femmes atteintes de HGSC avec une sensibilité et une spécificité maximales. Plus de 98% des HGSC portent des mutations dans TP53, ce qui signifie que la DS ultra-profonde peut être concentrée de manière rentable sur une petite région génomique. Le produit de cet objectif sera un ensemble de données de biomarqueurs de 200 patientes qui démontre la performance rentable et commercialement robuste de ce diagnostic du cancer de l'ovaire indispensable.

Objectif 1A : Évaluer les performances du test TP53 DS sur les UtL pour la détection des HGSC chez les patients à risque moyen.

Méthodes : Des échantillons UtL de 200 sujets de la population à risque moyen seront analysés via DS : 100 sujets avec HGSC (cas) et 100 sujets avec des lésions qui se sont finalement avérées bénignes après résection, c'est-à-dire sans cancer (témoins). Chez toutes les patientes, UtL sera collecté avant une intervention chirurgicale pour une masse ovarienne. Le lavage sera effectué pendant la phase lutéale du cycle menstruel en cas de pré-ménopause. Les échantillons chirurgicaux seront évalués sur le plan pathologique et un patient sera compté comme HGSC positif ou comme témoin en fonction des résultats histologiques. Pour les patients atteints de cancer, la tumeur primaire sera séquencée par des méthodes conventionnelles par l'Université médicale de Vienne pour un panel de gènes comprenant TP53, BRCA1 et BRCA2. Pour tous les échantillons de patients anonymisés, les informations cliniques recueillies comprendront : l'âge, les antécédents de tabagisme, l'exposition antérieure à la chimiothérapie, la parité, l'âge de la ménopause, l'âge de la ménarche, les antécédents d'utilisation de contraceptifs oraux, les antécédents familiaux de cancer et sept statut de mutation génique de la tumeur primaire. Les cas et les témoins seront appariés selon l'âge et une tranche d'âge aussi large que possible sera incluse pour évaluer l'effet de l'âge sur la sensibilité et la spécificité.

Analyse statistique : un profil de mutation détaillé pour chaque échantillon sera généré à partir des fichiers de sortie du séquençage duplex, y compris : la fréquence des allèles mutants (MAF) pour toutes les positions mutées, le spectre de mutation, la pathogénicité prévue pour la fonction des protéines, la relation avec les points chauds connus et la charge globale de mutation (nombre de nucléotides mutants divisé par le nombre total de nucléotides séquencés). Suite à cela, les échantillons seront levés en aveugle pour le statut des cas-témoins. TP53 MAF à partir d'ADN collecté par les UtLs sera utilisé comme prédicteur pour différencier les patients à risque moyen (AIM I) avec et sans HGSC par modélisation de régression logistique. L'âge, les antécédents de tabagisme, l'exposition antérieure à la chimiothérapie, la parité, l'âge de la ménopause, l'âge de la ménarche, les antécédents d'utilisation de contraceptifs oraux, les antécédents familiaux de cancer et le statut de mutation germinale seront considérés comme des facteurs de confusion potentiels. La prédiction du modèle sera évaluée par validation croisée. Une analyse analogue sera appliquée au groupe de patients à haut risque (AIM II) où la présence et l'absence de STIC définissent la variable de résultat. Des valeurs seuils pour la fréquence des allèles mutants seront suggérées dans les deux cas et la spécificité et la sensibilité seront estimées, y compris les intervalles de confiance appropriés.

Objectif 1B : Améliorer les performances diagnostiques avec un étalonnage personnalisé par charge de mutation de fond.

La sensibilité sans précédent de DS nous a conduits ensuite à la nouvelle découverte que les mutations cancéreuses s'accumulent à des niveaux très bas avec l'âge dans de multiples tissus humains. Dans une étude pilote, le promoteur a découvert que la charge moyenne de mutations BB est quelque peu plus élevée dans les UtL que dans les autres tissus, potentiellement en raison de la contribution de l'ADN du tissu endométrial, qui se réplique largement avant la ménopause. Bien que cela n'ait pas compromis la spécificité de l'étude pilote, le promoteur reconnaît que le BB pourrait constituer un obstacle avec certaines tumeurs très précoces où le signal MAF est faible, ou avec des femmes très âgées où le fond est élevé. Le promoteur s'attend à ce que la filtration par lavage et la collecte de la phase lutéale chez les femmes préménopausées réduisent le signal BB, mais comme mesure supplémentaire, le promoteur examinera si les performances peuvent être encore améliorées en normalisant la charge de mutation de fond d'un individu. Le promoteur émet l'hypothèse que le niveau de mutations TP53 dans les leucocytes en circulation peut servir de calibrateur personnel mesuré empiriquement qui capture non seulement les facteurs connus qui augmentent le BB, tels que l'âge, mais également les expositions mutagènes inconnues ou d'autres facteurs survenant au cours de la vie d'une personne. Bien que l'ADN des leucocytes ne contribue probablement qu'une quantité minime au pool total de mutations BB dans les UtL, le promoteur affirme qu'ils pourraient servir de "canari dans une mine de charbon" proverbial qui sera proportionnellement représentatif des mutations BB ailleurs dans le corps. La charge de mutation BB dans un lavage, elle-même, ne peut pas être directement mesurée dans un environnement réel lorsque la ou les mutations contribuées par une tumeur sont inconnues. La plausibilité de ce concept a été démontrée par notre étude initiale des mutations TP53 dans le liquide péritonéal, qui comprenait un sous-ensemble d'échantillons sanguins correspondants et indiquait une forte association entre BB et l'âge.

Méthodes : L'ADN du composant des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) - collecté immédiatement avant une intervention chirurgicale - de 50 cas de HGSC choisis au hasard sur 100 et de 50 sur 100 témoins de l'objectif 1A sera extrait et soumis à TP53 DS à ~ 10 000x moléculaire profondeur. Les mutations TP53 des PBMC seront soustraites des mutations TP53 trouvées dans l'UtL.

Analyse statistique : Le promoteur examinera l'association entre les fréquences de mutation TP53 dans UtL et les leucocytes et déterminera si les faux négatifs dans le but 1A correspondent à des cas avec une augmentation de BB dans les leucocytes. En outre, le promoteur analysera les fréquences de mutation TP53 dans les leucocytes en tant que prédicteur du statut de cas-témoin, en utilisant à nouveau la procédure d'exclusion de 10 %. Cette méthode d'étalonnage innovante sera comparée aux métriques ROC simples obtenues avec le modèle univarié utilisant une fraction de mutation fixe ainsi qu'avec le modèle multivarié ajusté développé sur la base d'autres caractéristiques du patient telles que l'âge. En tant que question scientifique sans rapport avec les objectifs actuels, le promoteur est impatient de voir si la charge de mutation des leucocytes TP53 servira de prédicteur indépendant de l'âge du patient, de son état de santé général ou de ses antécédents d'exposition mutagène.

Objectif 1C. Comparaison des performances diagnostiques du lavage utérin par rapport à l'ADN recueilli par frottis de Pap.

Le premier rapport sur l'utilisation du NGS pour la détection du cancer de l'ovaire à partir d'une biopsie liquide transvaginale reposait sur la collecte de frottis Pap et SafeSeqS comme technologie de séquençage. La sensibilité citée de 41 % a fourni une preuve de principe importante, mais également une grande marge d'amélioration. Le sponsor a définitivement démontré la précision supérieure de DS par rapport aux méthodes de type SafeSeqS et les études en cours dans notre laboratoire indiquent une sensibilité limitée des frottis Pap par rapport à UtL. Cependant, une comparaison directe des deux méthodes de collecte sur les mêmes patients reste à effectuer. Démontrer formellement le degré de supériorité de l'UTL sur les frottis Pap aidera à l'entrée sur le marché commercial (le sponsor note qu'un NCI SBIR connexe a été attribué à PapGene Inc, une société fondée par les auteurs de l'étude susmentionnée). La supériorité de l'UtL est attendue sur la base du fait que les lavages atteignent les trompes de Fallope et les surfaces ovariennes alors que les frottis Pap reposent sur des cellules cancéreuses disséminées atteignant le canal cervical. Néanmoins, dans le cas où TP53 DS sur les frottis Pap ne sous-performerait pas considérablement l'UtL, le promoteur explorerait davantage cette méthode de collecte complémentaire. Étant donné que les frottis Pap sont régulièrement effectués par des prestataires de soins primaires, la possibilité de les utiliser pourrait aider à accélérer l'adoption par le marché. Cependant, les preuves actuelles indiquent l'infériorité probable des frottis Pap.

Méthodes : Le promoteur effectuera le TP53 DS comme ci-dessus, mais en utilisant l'ADN des frottis Pap recueillis avant la chirurgie d'un sous-ensemble sélectionné au hasard et apparié selon l'âge de 25 cas de cancer et de 25 témoins de l'objectif 1A.

Analyse statistique : les données sur le MAF TP53 à partir d'ADN collectées par des tests de frottis conventionnels à partir d'un sous-échantillon de patients à risque moyen seront considérées comme un prédicteur supplémentaire dans les modèles développés dans le cadre des objectifs 1A et 1B. Le promoteur étudiera s'il existe un pouvoir supplémentaire pour discriminer les cas des témoins. peut être obtenue en combinant les informations des frottis Pap et des UtL.

OBJECTIF 2. DÉPISTAGE DU CANCER DE L'OVAIRE DANS LA POPULATION À HAUT RISQUE Cet objectif adoptera une approche similaire à celle de l'objectif 1, mais se concentrera sur les femmes à haut risque de cancer de l'ovaire en raison de mutations héréditaires du cancer du sein et de l'ovaire (HBOC). Les femmes HBOC auront été identifiées par de forts antécédents familiaux de cancer du sein ou de l'ovaire et porteuses de mutations dans les gènes de susceptibilité au cancer, généralement BRCA1 et BRCA2, qui confèrent un risque à vie de HGSC de 35 %, 46 % et 13 %, 23 %, respectivement. La norme de soins est la réduction du risque d'ovariectomie salpingo (RRSO) à un âge précoce, généralement après la fin de la procréation. Bien que cette approche diminue la mortalité, elle est imparfaite : environ 10 % des cancers de l'ovaire dans cette population se développent avant l'âge de 40 ans. Dans la série de cas de Vienne, des cancers ont été observés dès l'âge de 20 ans, ce qui est bien avant qu'une chirurgie prophylactique n'ait normalement été entreprise. Ainsi, même avec la norme de soins, les femmes HBOC en âge de procréer courent un risque significativement élevé de cancer de l'ovaire par rapport aux autres femmes, leur besoin d'un outil de dépistage efficace est encore plus grand. À l'heure actuelle, les femmes touchées doivent prendre la décision d'accepter le risque accru d'un cancer hautement mortel ou de choisir d'oublier (ou de mettre fin prématurément) à la procréation. Il s'agit d'une décision extrêmement difficile à laquelle sont confrontées des centaines de milliers de femmes aux États-Unis seulement. Dans certains groupes ethniques, en particulier les juifs ashkénazes, le risque d'être porteur atteint 1 sur 40. Pourtant, la majorité des porteurs de BRCA, même ceux qui n'ont pas subi de chirurgie, ne développeront jamais de HGSC. Il existe un besoin urgent d'outils de diagnostic de détection précoce chez les femmes à haut risque de HGCS afin de sauver des vies et de préserver le choix de la fertilité. Le produit de cet objectif sera un ensemble de données de biomarqueurs de 115 patients qui démontre la performance commercialement robuste d'un tel test.

Objectif 2A. Évaluer les performances du test TP53 DS sur les UtL pour la détection des HGSC chez les patients à haut risque.

Le promoteur abordera cette étude selon les méthodes générales de l'objectif 1A. Une différence significative est que l'UtL sera collecté auprès de femmes HBOC subissant une RRSO, plutôt qu'auprès de femmes ayant des masses ovariennes connues. Après RRSO, les ovaires et les trompes de Fallope subissent un protocole de sectionnement méticuleux appelé SEE-FIM pour examiner attentivement les tissus, en particulier les fimbriae, à la recherche de STIC et de cancers occultes. Parmi cette population à haut risque, de telles lésions sont retrouvées dans environ 5 % des résections. Le groupe cancer comprendra des femmes chez lesquelles des STIC ou des tumeurs occultes ont été découvertes au cours du SEE-FIM, le groupe témoin comprendra des femmes sans lésions. Cette conception de l'étude est innovante en ce qu'elle se concentre, non seulement sur les femmes à haut risque, mais spécifiquement sur la capacité de notre test à détecter des cancers à un stade très précoce, potentiellement même microscopiques, lorsqu'ils restent chirurgicalement curables.

Méthodes : Des échantillons UtL de jusqu'à 115 femmes atteintes de syndromes héréditaires de cancer de l'ovaire à haut risque seront analysés via DS : 15 avec STIC ou cancer occulte (cas) et jusqu'à 100 sans cancer (témoins). Le cas et le contrôle seront appariés selon l'âge. Les UtL seront exécutés immédiatement avant le RRSO. Les spécimens chirurgicaux seront évalués pathologiquement par un protocole SEE-FIM standardisé au niveau central. Après RRSO, les ovaires et les trompes de Fallope subissent un protocole de sectionnement méticuleux appelé SEE-FIM pour examiner attentivement les tissus, en particulier les fimbriae, à la recherche de STIC et de cancers occultes. Le promoteur s'attend à avoir identifié 5 à 15 femmes atteintes de STIC ou de cancers occultes dans cette cohorte, 100 femmes appariées selon l'âge n'auront aucune lésion détectée. Le plus petit nombre de cas de cancer que de témoins reflète le faible pourcentage de chirurgies positives pour les lésions et le nombre d'échantillons que le projet du sponsor est en mesure d'atteindre de manière réaliste. Bien qu'un plus grand nombre soit optimal, de tels échantillons sont extrêmement limités. Le groupe de cancer comprendra des femmes chez lesquelles des STIC ou des HGSC occultes ont été trouvés au cours du SEE-FIM, le groupe témoin comprendra des femmes sans lésions. Analyse statistique : ce sera conformément à l'objectif 1A.

Objectif 2B. Étalonnage du seuil de diagnostic chez les femmes à haut risque par charge de mutation de fond.

Ce sous-objectif utilisera le même protocole et les mêmes méthodes statistiques que l'objectif 1B et les appliquera à la population à haut risque de l'objectif 2.

Méthodes : L'ADN leucocytaire de tous les cas de cancer disponibles et d'un sous-ensemble de 30 femmes du groupe témoin choisi au hasard sera évalué. Il est bien établi que le risque de malignité chez les femmes HBOC est élevé par rapport aux autres en raison de défauts de réparation de l'ADN qui augmentent la probabilité d'apparition de mutations oncogènes. En tant que tel, le promoteur prévoit que la charge de mutations de fond non dérivées du cancer mesurée dans les UtL ainsi que dans le sang périphérique peut également être proportionnellement élevée. L'ajustement pour la charge de mutation de fond élevée mesurée dans le sang peut être particulièrement important pour augmenter la spécificité dans ce groupe.

Analyse statistique : Cela sera conforme à l'objectif 1B.

OBJECTIF III Définir une signature de méthylation pour la détection des HGSC dans les UtLs. Au cours des 15 dernières années, la valeur de l'analyse de la méthylation de l'ADN pour la détection des changements épigénétiques spécifiques aux tumeurs a été démontrée, en particulier dans le diagnostic du cancer. Les études sur la méthylation de l'ADN dans le cancer de l'ovaire (CO) se sont concentrées sur la détection de fragments d'ADN rejetés par les cellules OC dans la circulation sanguine (c.-à-d. cell-free DNA - cfDNA) suggèrent que les schémas de méthylation de l'ADN dans le cfDNA ont le potentiel de détecter une proportion d'OC jusqu'à deux ans avant le diagnostic. Cette étude montre également clairement la limite de cette approche car seulement 50% de toutes les patientes qui ont finalement développé un cancer séreux de l'ovaire (HGSC) de haut grade dans les deux ans ont pu être détectées. Le problème sous-jacent est qu'en raison de la faible concentration de cfDNA dans la circulation sanguine, un signal très faible doit être détecté. Dans le but d'augmenter potentiellement la sensibilité de la détection des HGSC, le promoteur, en coopération avec le professeur Andreas Weinhäusel, Institut autrichien de technologie (AIT), Unité de compétence Diagnostics moléculaires, réalisera une étude de preuve de concept dans un sous-ensemble de patients inclus dans ce projet. Le professeur Andreas Weinhäusel a identifié 96 marqueurs de méthylation pertinents pour l'HGSC. Seule une très petite quantité d'ADN est nécessaire pour la méthylation de l'ADN. Il est donc conseillé d'utiliser l'ADN déjà disponible des lavages et le tissu tumoral correspondant, qui a été extrait au cours de cette étude, pour le développement ultérieur de la spécificité et de la sensibilité de la procédure de test. Le produit d'AIM3 sera un ensemble de données de marqueurs de méthylation de 140 patients qui démontre les performances hautement sensibles d'un tel test.

Méthodes : L'ADN génomique des UtL et le tissu tumoral correspondant de 30 patients HGSC et 10 STIC/cancers occultes seront enrichis en ADN méthylé à l'aide d'enzymes de restriction sensibles à la méthylation. Cet ADN sera analysé en effectuant une put-qPCR à haut débit dans laquelle 5 x 96 marqueurs x 96 ADN seront analysés en parallèle. Les marqueurs les plus informatifs seront associés à une signature de méthylation. Pour prouver la spécificité de la signature ADN des UtL de 60 témoins seront analysés (30 cas à risque moyen et 30 cas à haut risque). L'évaluation du schéma de méthylation de l'ADN sera effectuée sur les lavages pré-résection et sur jusqu'à 10 lésions STIC/cancers occultes. Lorsque les résultats de la pathologie locale identifient des STIC ou des cellules cancéreuses occultes (tissu FFPE), une microdissection au laser et un isolement de l'ADN seront effectués. Par la suite, l'application du séquençage NGS TP53 standard sera effectuée comme décrit dans AIM 1 et AIM 2. Dans cette sous-étude pilote, la put-qPCR à haut débit sera appliquée au matériel d'ADN restant pour l'évaluation de l'état de méthylation.

Analyse statistique : Dans le but d'évaluer le potentiel de définition d'une signature ADN-méthylation pour un test PCR simple, les valeurs dCT-PCR de l'analyse MSREqPCR à haut débit à 96 plexes seront analysées par bioinformatique et biostatistique pour effectuer 1) une comparaison de classe entre les cliniques pertinentes des sous-types et des classes pour définir des gènes significativement différentiellement méthylés ; 2) analyse de prédiction de classe multivariée utilisant différentes approches de sélection de caractéristiques basées sur des valeurs p à marqueur unique. Différents algorithmes de classification (par ex. k-voisin le plus proche, machines à vecteurs de support, analyses de discrimination linéaire, etc.) seront appliqués, en utilisant une validation croisée 10 fois et/ou une validation croisée sans omission pour sélectionner les meilleurs marqueurs de méthylation candidats - et algorithmes ; en outre, les valeurs AUC supérieures des marqueurs de méthylation candidats uniques seront définies dans l'analyse ROC et prises en compte pour la sélection des marqueurs.

Un sous-ensemble de 48 marqueurs candidats sera sélectionné pour confirmation dans un ensemble d'échantillons distinct. Les données de méthylation dérivées de celles-ci seront analysées en utilisant une comparaison de classe et une analyse de prédiction de classe d'une manière similaire au premier ensemble de données dérivées d'une analyse 480plexée. Les marqueurs uniques les plus performants et les combinaisons de marqueurs issus de l'analyse multivariée seront définis. Les résultats de la classification et les données de méthylation seront comparés aux résultats des tests de mutation p53 pour évaluer le potentiel de la classification diagnostique basée sur la méthylation, seule et en combinaison avec l'analyse de la mutation p53. Cela sera mené en appliquant différentes approches de prédiction de classe intégrant à la fois les données de p53 et de méthylation dans des modèles multivariés.