Tidig upptäckt av höggradig äggstockscancer med EHUD-studie och duplexsekvensering av livmodersköljning (EHUD)

APPARAT FAS I University of Washington har visat diagnostiska principbevis; ytterligare optimering och validering behövs dock för utbyggnad i industriell skala. I fas I kommer UL-filtreringsmetoden att optimeras (Mål 1), analytisk prestanda på det kommersiella arbetsflödet valideras (Syfte 2) och en milstolpe för provinsamling uppnås (Mål 3). Syfte 1. Bestäm användbarheten av uterinsköljningsfiltrering för att maximera anrikningen av tumörhärlett DNA. Preliminära tester med två prover indikerade att filtrering av UtLs för att ta bort kluster av endometrieceller kunde öka känsligheten för tumörmutationer flera gånger. Denna datauppsättning kommer att utökas genom att analysera filtreringseffekten i 10 UL från patienter med HGSC med kända TP53-mutationer. Varje UL kommer att delas i hälften: den första halvan kommer att filtreras och den andra kommer att förbli ofiltrerad. DNA kommer att extraheras från de filtrerade, filtratet och ofiltrerade fraktionerna och analyseras med TP53 DS (totalt 30 prover). För varje UtL kommer DNA-utbytet i var och en av fraktionerna och MAF för tumörmutationen att jämföras. Det förväntas att den filtrerade fraktionen kommer att innehålla mindre DNA än den ofiltrerade fraktionen men tumörmutationen kommer att vara närvarande vid en högre frekvens. Om känsligheten förbättras (dvs. mer vinnas genom anrikning än som går förlorad genom reduktion från mindre tillgängligt DNA), kommer filtrering att användas på alla framtida insamlade prover. Syfte 2. Validering av optimerad analys: noggrannhet, precision, detektionsgräns och reproducerbarhet. TwinStrand har utvecklat ett strömlinjeformat DS-arbetsflöde med hjälp av förbättrade adaptrar, ligeringskemi och ett 96-brunnars plattbaserat format med hög genomströmning som är tillgängligt för vätskehanteringsrobotar och kompatibelt med CLIAs laboratoriestandarder.

TwinStrand har också utvecklat en optimerad molnbaserad analyspipeline som stöder automatiserad parallell bearbetning av flera prover. Den optimerade processen för detektion av TP53-mutationer i UL-prover kommer att valideras. För att bedöma noggrannhet, teknisk precision och nedre detektionsgräns kommer DNA-prover från två individer som skiljer sig i genotyp vid >5 SNP-ställen i eller nära TP53 att blandas, i förhållanden från 1:100 1:5 000, två UtL. Blandningarna kommer att sekvenseras vid ~10 000x molekylärt djup i två oberoende experiment. SNP-allelfraktion (AF) kommer att jämföras vid olika spädningar för att bestämma noggrannhet (förväntad AF vs. observerad AF), precision (AF-variation bland replikat) och lägsta detektionsgräns som kan uppnås. För att testa analysens reproducerbarhet i dess avsedda kliniska användning, kommer sekvensering att upprepas på de 30 prover som används Mål 1, som kommer att omfatta ett brett spektrum av tumör-MAF. Sponsorn kommer att beräkna variationskoefficienten mellan replikat. Baserat på pilotstudier förväntar sponsorn utmärkt reproducerbarhet (CV<5%). Syfte 3. Provtagning. Samling av prover som föreslås i fas II kommer att påbörjas under lämpligt godkännande av IRB/etisk kommitté vid varje deltagande institution.

Efter insamling skickas proverna till Institutet för cancerforskning vid Medical University of Vienna som kommer att utföra UL-filtrering och DNA-extraktion.

Parat DNA från cellprov och perifera leukocyter kommer också att extraheras. Isolerade DNA kommer att tilldelas ett identifieringsnummer och skickas till TwinStrand för duplexsekvensering.

Fas I-milstolpar:

1. Bekräfta användbarheten av UtL-filtrering på tumörmutationsanrikning.
2. Kvantifiera strömlinjeformad analyss noggrannhet, precision, nedre detektionsgräns och reproducerbarhet på ULs.
3. Starta provinsamling för fas II.

Fas I-produkter:

1. DS-arbetsflöde redo för applicering på UtL DNA i kommersiell skala i fas II och fas III.
2. Provbank för fas II

METOD FAS II Fas II kommer att validera användningen av TP53 DS på ULs för tidig upptäckt av äggstockscancer i utökade patientkohorter för fallkontroll som omfattar både genomsnittliga och högriskpopulationer. Fördefinierade parametrar som kan påverka känsligheten och specificiteten för TP53-mutationsfrekvensen kommer att undersökas och modelleras statistiskt. Klinisk känslighet och specificitet kommer att maximeras genom att bygga personliga statistiska diagnostiska tröskelmodeller med hjälp av multivariata kliniska egenskaper, såväl som varje individs unika bakgrundsmutationsbelastning baserat på leukocytsekvensering. Hos en undergrupp av patienter kommer den överlägsna prestandan av UL-prov över cellprovstagning att bekräftas. Dessutom kommer en proof of concept-studie att genomföras i en undergrupp av inkluderade patienter för att studera en uppsättning av 96 metyleringsmarkörer som är relevanta för HGSC i utls och motsvarande tumörvävnad/STIC.

SYFTE 1. ALLMÄN POPULATION SCREENING AV OVARIACANCER Detta syfte kommer att utveckla en biomarkör för HGSC-detektion i en genomsnittlig riskpopulation. Sponsorn kommer att genomföra en fallkontrollstudie som integrerar TP53 DS mutationsdata med klinikpatologisk information för att identifiera kvinnor med HGSC med maximal känslighet och specificitet. Mer än 98% av HGSCs bär mutationer i TP53, vilket innebär att ultradjup DS kan kostnadseffektivt fokuseras på bara en liten genomisk region. Produkten av detta mål kommer att vara en datauppsättning av biomarkörer för 200 patienter som visar den kostnadseffektiva, kommersiellt robusta prestandan för denna kritiskt nödvändiga diagnostik för äggstockscancer.

Syfte 1A: Att bedöma testprestanda för TP53 DS på ULs för HGSC-detektion hos patienter med genomsnittlig risk.

Metoder: UtL-prover från 200 försökspersoner från genomsnittlig riskpopulation kommer att analyseras via DS: 100 försökspersoner med HGSC (fall) och 100 försökspersoner med lesioner som slutligen visade sig vara godartade efter resektion, dvs utan cancer (kontroller). Hos alla patienter kommer UtL att samlas in före kirurgisk ingrepp för en ovariemassa. Sköljning kommer att utföras under den luteala fasen av menstruationscykeln om den är premenopausal. Kirurgiska prover kommer att bedömas patologiskt, och en patient kommer att räknas som HGSC-positiv eller en kontroll beroende på de histologiska resultaten. För cancerpatienter kommer den primära tumören att sekvenseras med konventionella metoder av Medical University of Vienna för en panel av gener som inkluderar TP53, BRCA1 och BRCA2. För alla avidentifierade patientprover kommer insamlad klinisk information att inkludera: ålder, rökhistoria, tidigare exponering för kemoterapi, paritet, klimakteriets ålder, menarkens ålder, anamnes på p-piller, cancerfamiljens historia och sju- genmutationsstatus för den primära tumören. Fall och kontroller kommer att åldersmatchas och ett så brett åldersintervall som möjligt kommer att inkluderas för att bedöma effekten av ålder på sensitivitet och specificitet.

Statistisk analys: En detaljerad mutationsprofil för varje prov kommer att genereras från utdatafilerna för duplexsekvensering inklusive: mutant allelfrekvens (MAF) för alla muterade positioner, mutationsspektrum, förutspådd patogenicitet till proteinfunktion, förhållande till kända hotspots och total mutationsbelastning (antal mutantnukleotider dividerat med det totala antalet sekvenserade nukleotider). Efter detta kommer proverna att avblindas för fall-kontrollstatus. TP53 MAF från DNA som samlats in av UtLs kommer att användas som prediktor för att skilja mellan medelriskpatienter (AIM I) med och utan HGSC genom logistisk regressionsmodellering. Ålder, rökhistoria, tidigare exponering för kemoterapi, paritet, klimakteriets ålder, menarkens ålder, historia av p-piller, cancerfamiljshistoria och könscellsmutationsstatus kommer att betraktas som potentiella störande faktorer. Modellförutsägelse kommer att bedömas genom korsvalidering. En analog analys kommer att tillämpas på gruppen av högriskpatienter (AIM II) där närvaro och frånvaro av STIC definierar utfallsvariabeln. Cut-off-värden för mutant allelfrekvens kommer att föreslås i båda fallen och specificitet och sensitivitet kommer att uppskattas inklusive lämpliga konfidensintervall.

Syfte 1B: Förbättra diagnostisk prestanda med personlig kalibrering genom bakgrundsmutationsbelastning.

Den oöverträffade känsligheten hos DS ledde oss sedan andra till den nya upptäckten att cancerliknande mutationer ackumuleras på mycket låga nivåer med åldern i flera mänskliga vävnader. I en pilotstudie upptäckte sponsorn att den genomsnittliga BB-mutationsbelastningen är något högre i ULs än andra vävnader, potentiellt på grund av DNA-bidrag från endometrievävnad, som replikerar omfattande före klimakteriet. Även om detta inte kompromissade specificiteten i pilotstudien, inser sponsorn att BB kan utgöra ett hinder för vissa mycket tidiga tumörer där MAF-signalen är låg, eller med mycket äldre kvinnor där bakgrunden är hög. Sponsorn förväntar sig att sköljfiltrering och lutealfasuppsamling hos premenopausala kvinnor kommer att minska BB-signalen, men som en extra åtgärd kommer sponsorn att undersöka om prestandan kan förbättras ytterligare genom att normalisera för en individs bakgrundsmutationsbelastning. Sponsorn antar att nivån av TP53-mutationer i cirkulerande leukocyter kan fungera som en empiriskt uppmätt personlig kalibrator som fångar inte bara kända faktorer som ökar BB, såsom ålder, utan även okända mutagena exponeringar eller andra faktorer som inträffar under en persons liv. Även om DNA från leukocyter förmodligen bara bidrar med en minimal mängd till den totala poolen av BB-mutationer i UtLs, menar sponsorn att de kan fungera som en ökända "kanarie i en kolgruva" som kommer att vara proportionellt representativ för BB-mutationer på andra ställen i kroppen. BB-mutationsbelastningen i en sköljning i sig kan inte direkt mätas i en verklig miljö när mutationen/mutationerna som en tumör bidrar med är okända. Sannolikheten i detta koncept visades av vår första studie av TP53-mutationer i peritonealvätska, som inkluderade en undergrupp av matchande blodprover och indikerade ett starkt samband mellan BB och ålder.

Metoder: DNA från komponenten perifera mononukleära blodceller (PBMC) - insamlat omedelbart före en operation - av slumpmässigt utvalda 50 från 100 HGSC-fall och 50 från 100 kontroller från Mål 1A kommer att extraheras och utsättas för TP53 DS vid ~10 000x molekylär djup. TP53-mutationer från PBMC:er kommer att subtraheras från TP53-mutationer som finns i UtL.

Statistisk analys: Sponsorn kommer att undersöka sambandet mellan TP53-mutationsfrekvenser i UtL och leukocyter och kommer att avgöra om falskt negativa i mål 1A motsvarar fall med ökad BB i leukocyter. Dessutom kommer sponsorn att analysera TP53-mutationsfrekvenser i leukocyter som en prediktor för fallkontrollstatus, återigen genom att använda utelämna 10%-proceduren. Denna innovativa kalibreringsmetod kommer att jämföras med de enkla ROC-måtten som uppnås med den univariata modellen med en fast mutationsfraktion samt den justerade multivariatmodellen som utvecklats baserat på andra patientegenskaper som ålder. Som en vetenskaplig fråga som inte är relaterad till de nuvarande målen är sponsorn ivriga att se om leukocyt TP53-mutationsbelastningen kommer att fungera som en oberoende prediktor för patientens ålder, övergripande hälsa eller historia av mutagena exponeringar.

Sikta 1C. Jämförelse av diagnostisk prestanda för livmodersköljning kontra cellprovsuppsamlat DNA.

Den första rapporten om användning av NGS för upptäckt av äggstockscancer från en transvaginal vätskebiopsi förlitade sig på cellprovsinsamling och SafeSeqS som sekvenseringsteknik. Den angivna känsligheten på 41 % gav ett viktigt principbevis, men också gott om utrymme för förbättringar. Sponsorn har definitivt visat den överlägsna noggrannheten hos DS jämfört med SafeSeqS-liknande metoder och pågående studier i vårt labb indikerar begränsad känslighet för cellprover jämfört med UtL. En direkt jämförelse av de två insamlingsmetoderna på samma patienter återstår dock att göra. Att formellt visa graden av överlägsenhet hos UtL över Pap-utstryk kommer att hjälpa till med kommersiell marknadsinträde (sponsorn noterar att en relaterad NCI SBIR har tilldelats PapGene Inc, ett företag som grundats av ovan nämnda studies författare). UtL:s överlägsenhet förväntas baserat på det faktum att sköljningarna når äggledarna och äggstocksytorna medan cellprover förlitar sig på spridda cancerceller som når livmoderhalskanalen. Icke desto mindre, i händelse av att TP53 DS på cellprover inte drastiskt underpresterar UL, skulle sponsorn ytterligare utforska denna kompletterande insamlingsmetod. Eftersom cellprover rutinmässigt utförs av primärvårdsleverantörer, kan möjligheten att använda dessa hjälpa till att påskynda marknadsintroduktionen. Men aktuella bevis pekar på den troliga underlägsenheten av cellprover.

Metoder: Sponsorn kommer att utföra TP53 DS enligt ovan men med hjälp av DNA från cellprov som samlats in före operation av slumpmässigt utvalda, åldersmatchade undergrupper av 25 cancerfall och 25 kontroller från Mål 1A.

Statistisk analys: Data om TP53 MAF från DNA som samlats in genom konventionella cellprovsprov från ett delprov av patienter med genomsnittlig risk kommer att betraktas som ytterligare prediktorer i modeller utvecklade inom mål 1A och 1B. Sponsorn kommer att undersöka om det finns ytterligare befogenheter att skilja fall från kontroller kan erhållas genom att kombinera information från cellprov och utstryk.

SYFTE 2. SCREENING AV POPULATION AV HÖG RISK OVARIANCANCER Detta mål kommer att ha en liknande strategi som mål 1 men kommer att fokusera på kvinnor med hög risk för äggstockscancer på grund av ärftliga mutationer i bröst- och äggstockscancer (HBOC). HBOC-kvinnor kommer att ha identifierats av en stark familjehistoria av bröst- eller äggstockscancer och visat sig bära på mutationer i cancermottaglighetsgener, vanligtvis BRCA1 och BRCA2, som ger en livslång HGSC-risk på 35 %, 46 % och 13 %, 23 %, respektive. Vårdstandarden är riskreducerande salpingo-ooforektomi (RRSO) vid tidig ålder, vanligtvis efter avslutad förlossning. Även om detta tillvägagångssätt minskar dödligheten, är det ofullkomligt: ​​cirka 10 % av äggstockscancer i denna population utvecklas före 40 års ålder. I fallserien Vienna har cancer setts i så ung ålder som 20 år, vilket är långt innan en profylaktisk operation normalt skulle ha genomförts. Även med standardvård löper HBOC-kvinnor i sina reproduktiva år en avsevärt förhöjd risk för äggstockscancer jämfört med andra kvinnor, deras behov av ett effektivt screeningverktyg är ännu större. För närvarande måste drabbade kvinnor fatta beslutet att antingen acceptera den ökade risken för en mycket dödlig cancer eller välja att glömma (eller i förtid avsluta) barnafödandet. Detta är ett olidligt utmanande beslut som hundratusentals kvinnor står inför bara i USA. I vissa etniska grupper, särskilt ashkenazijudar, är risken att bli bärare så hög som 1 av 40. Ändå kommer majoriteten av BRCA-bärare, även de som inte opereras, aldrig att utveckla HGSC. Det finns ett akut behov av diagnostiska verktyg för tidig upptäckt hos kvinnor med hög risk för HGCS för att rädda liv och bevara valet av fertilitet. Produkten av detta mål kommer att vara en datauppsättning av biomarkörer för 115 patienter som visar kommersiellt robust prestanda för en sådan analys.

Mål 2A. För att bedöma testprestanda för TP53 DS på ULs för HGSC-detektion hos högriskpatienter.

Sponsorn kommer att närma sig denna studie enligt de allmänna metoderna i Mål 1A. En betydande skillnad är att UtL kommer att samlas in från HBOC-kvinnor som genomgår RRSO, snarare än från kvinnor med känd äggstocksmassor. Efter RRSO genomgår äggstockarna och äggledarna ett noggrant snittprotokoll känt som SEE-FIM för att noggrant undersöka vävnaderna, särskilt fimbriae, för STIC och ockult cancer. Bland denna högriskpopulation finns sådana lesioner i ungefär 5 % av resektionerna. Cancergruppen kommer att omfatta kvinnor där STIC eller ockulta tumörer hittades under SEE-FIM, kontrollgruppen kommer att inkludera kvinnor utan lesioner. Denna studiedesign är innovativ genom att den fokuserar, inte bara på högriskkvinnor, utan specifikt på vår analyss förmåga att upptäcka cancer i mycket tidigt stadium, potentiellt till och med mikroskopiska, när de förblir kirurgiskt botade.

Metoder: UtL-prover från upp till 115 kvinnor med ärftliga äggstockscancersyndrom med hög risk kommer att analyseras via DS: 15 med STIC eller ockult cancer (fall) och upp till 100 cancerfria (kontroller). Fodral och kontroll kommer att matchas efter ålder. UtLs kommer att utföras omedelbart före RRSO. Kirurgiska prover kommer att bedömas patologiskt med ett centralt standardiserat SEE-FIM-protokoll. Efter RRSO genomgår äggstockarna och äggledarna ett noggrant snittprotokoll känt som SEE-FIM för att noggrant undersöka vävnaderna, särskilt fimbriae, för STIC och ockult cancer. Sponsorn förväntar sig att ha identifierat 5 till 15 kvinnor med STIC eller ockult cancer i denna kohort, 100 åldersmatchade kvinnor kommer inte att ha några upptäckta lesioner. Det mindre antalet cancerfall än kontroller speglar den låga andelen lesionspositiva operationer och det antal prov som sponsorprojektet realistiskt kan uppnå. Även om ett större antal skulle vara optimalt är sådana prover extremt begränsade. Cancergruppen kommer att omfatta kvinnor där STIC eller ockult HGSC hittades under SEE-FIM. Kontrollgruppen kommer att inkludera kvinnor utan lesioner. Statistisk analys: Detta kommer att vara enligt mål 1A.

Mål 2B. Diagnostisk tröskelkalibrering hos kvinnor med hög risk genom bakgrundsmutationsbelastning.

Detta delmål kommer att använda samma protokoll och statistiska metoder för mål 1B och tillämpa dem på den hög-r i s k populationen av mål 2.

Metoder: Leukocyt-DNA från alla tillgängliga cancerfall och en slumpmässigt vald 30-kvinnors undergrupp av kontrollgruppen kommer att utvärderas. Det är väletablerat att risken för malignitet hos HBOC-kvinnor är förhöjd i förhållande till andra på grund av defekter i DNA-reparation som ökar sannolikheten för att onkogena mutationer ska uppstå. Som sådan förutser sponsorn att den icke-cancerhärledda bakgrundsmutationsbelastningen mätt i ULs såväl som i perifert blod också kan vara proportionellt förhöjd. Justering för den höga bakgrundsmutationsbelastningen uppmätt i blod kan vara särskilt viktig för att öka specificiteten i denna grupp.

Statistisk analys: Detta kommer att vara enligt Mål 1B.

SYFTE III Att definiera en metyleringssignatur för HGSC-detektion i UtLs. Under de senaste 15 åren har värdet av DNA-metyleringsanalys för detektering av epigenetiska, tumörspecifika förändringar visats, särskilt inom cancerdiagnostik. Studier av DNA-metylering vid äggstockscancer (OC) fokuserade på att detektera DNA-fragment som släpps ut av OC-celler i blodomloppet (dvs. cellfritt DNA - cfDNA) tyder på att DNA-metyleringsmönster i cfDNA har potential att upptäcka en andel OC upp till två år före diagnos. Denna studie visar också tydligt begränsningen av detta tillvägagångssätt eftersom endast 50 % av alla patienter som slutligen utvecklade höggradig serös äggstockscancer (HGSC) inom två år kunde upptäckas. Det underliggande problemet är att på grund av den låga koncentrationen av cfDNA i blodomloppet måste en mycket svag signal detekteras. I syfte att potentiellt öka känsligheten för HGSC-detektion kommer sponsorn i samarbete med Prof. Andreas Weinhäusel, Austrian Institute of Technology (AIT), kompetensenheten Molecular Diagnostics, utföra en proof of concept-studie i en undergrupp av patienter som ingår i det här projektet. Prof. Andreas Weinhäusel, identifierade 96 metyleringsmarkörer som är relevanta för HGSC. Endast en mycket liten mängd DNA krävs för DNA-metylering. Det är därför tillrådligt att använda det redan tillgängliga DNA från sköljningarna och motsvarande tumörvävnad, som har extraherats under denna studie, för att vidareutveckla testprocedurens specificitet och känslighet. Produkten av AIM3 kommer att vara en datauppsättning för 140 patienters metyleringsmarkörer som visar högkänslig prestanda för en sådan analys.

Metoder: Genomiskt DNA från UtLs och motsvarande tumörvävnad från 30 HGSC-patienter och 10 STICs/ockulta cancerformer kommer att anrikas för metylerat DNA med hjälp av metyleringskänsliga restriktionsenzymer. Detta DNA kommer att analyseras genom att utföra en highthrough put-qPCR där 5 x 96 markör x 96 DNA kommer att analyseras parallellt. De mest informativa markörerna kommer att kombineras till en metyleringssignatur. För att bevisa specificiteten hos signaturen kommer DNA från UL från 60 kontroller att analyseras (30 genomsnittlig risk och 30 högriskfall). Bedömning av DNA-metyleringsmönster kommer att utföras på sköljningarna före resektion och på upp till 10 STIC-lesioner/ockulta cancerformer. När lokala patologiska resultat identifierar STIC eller ockulta cancerceller (FFPE-vävnad), kommer lasermikrodissektion och DNA-isolering att utföras. Efterföljande tillämpning av standard NGS TP53-sekvensering kommer att utföras enligt beskrivningen i AIM 1 och AIM 2. I denna pilotdelstudie kommer high-through put-qPCR att tillämpas på kvarvarande DNA-material för bedömning av metyleringsstatus.

Statistisk analys: Syftet är att utvärdera potentialen för att definiera en DNA-metyleringssignatur för enkel PCR-testning, dCT-PCR-värden från 96-plexad högkapacitets MSREqPCR-analys kommer att analyseras med bioinformatik och biostatistik för att göra 1) klassjämförelser mellan relevanta kliniska subtyper och klasser för att definiera signifikant differentiellt metylerade gener; 2) multivariat klassprediktionsanalys med användning av olika tillvägagångssätt för funktionsval baserat på enmarkörs p-värden. Olika klassificeringsalgoritmer (t.ex. k-närmaste granne, stödvektormaskiner, linjära diskrimineringsanalyser etc.) kommer att tillämpas med hjälp av 10-faldig korsvalidering och/eller utelämna korsvalidering för att välja bästa kandidatmetyleringsmarkörer - och algoritmer; dessutom kommer topp-AUC-värdena för enstaka kandidat-metyleringsmarkörer att definieras i ROC-analys och övervägas för markörval.

En delmängd av 48 kandidatmarkörer kommer att väljas ut för bekräftelse i en separat provuppsättning. De metyleringsdata som erhålls därav kommer att analyseras med användning av klassjämförelse och klassprediktionsanalys på ett liknande sätt som den första uppsättningen data som härrör från 480-plexad analys. Bäst presterande enstaka markörer och kombinationer av markörer från multivariatanalys kommer att definieras. Klassificeringsresultat och metyleringsdata kommer att jämföras med p53-mutationstestresultat för att utvärdera potentialen för metyleringsbaserad diagnostisk klassificering, som ensam och i kombination med p53-mutationsanalys. Detta kommer att genomföras med användning av olika klassprediktionsmetoder som integrerar både p53 och metyleringsdata i multivariata modeller.