Včasná detekce rakoviny vaječníků vysokého stupně pomocí studie EHUD výplachu dělohy a duplexního sekvenování (EHUD)

FÁZE PŘÍSTUPU I Washingtonská univerzita prokázala diagnostický důkaz principu; pro nasazení v průmyslovém měřítku je však zapotřebí další optimalizace a ověření. Ve fázi I bude optimalizována filtrační metoda UtL (Cíl 1), bude ověřen analytický výkon na komerčním pracovním postupu (Cíl 2) a bude splněn milník odběru vzorků (Cíl 3). Cíl 1. Stanovit užitečnost filtrace výplachu dělohy k maximalizaci obohacení DNA odvozenou od nádoru. Předběžné testování se dvěma vzorky ukázalo, že filtrace UtL k odstranění shluků endometriálních buněk by mohla několikanásobně zvýšit citlivost na nádorové mutace. Tento soubor dat bude rozšířen o analýzu efektu filtrace v 10 UtL od pacientů s HGSC se známými mutacemi TP53. Každý UtL bude rozdělen na polovinu: první polovina bude filtrována a druhá zůstane nefiltrovaná. Z filtrovaných, filtrátových a nefiltrovaných frakcí bude extrahována DNA a analyzována pomocí TP53 DS (celkem 30 vzorků). Pro každý UtL bude porovnán výtěžek DNA v každé z frakcí a MAF nádorové mutace. Předpokládá se, že filtrovaná frakce bude obsahovat méně DNA než frakce nefiltrovaná, ale nádorová mutace bude přítomna s vyšší frekvencí. Pokud se citlivost zlepší (tj. více se získá obohacením, než se ztratí redukcí z méně dostupné DNA), bude u všech budoucích odebraných vzorků použita filtrace. Cíl 2. Validace optimalizovaného testu: přesnost, preciznost, limit detekce a reprodukovatelnost. Společnost TwinStrand vyvinula zjednodušený pracovní postup DS využívající vylepšené adaptéry, ligační chemii a vysoce výkonný 96jamkový formát na bázi destiček vhodný pro roboty manipulující s kapalinami a kompatibilní s laboratorními standardy CLIA.

TwinStrand také vyvinul optimalizovaný cloudový analytický kanál, který podporuje automatizované paralelní zpracování více vzorků. Bude ověřen optimalizovaný proces detekce mutací TP53 ve vzorcích UtL. Pro posouzení přesnosti, technické preciznosti a spodní hranice detekce budou vzorky DNA od dvou jedinců, kteří se liší genotypem na >5 místech SNP v TP53 nebo v jeho blízkosti, smíchány v poměrech od 1:100 1:5 000, dva UtL. Směsi budou sekvenovány v ~10 000x molekulární hloubce ve dvou nezávislých experimentech. Frakce alely SNP (AF) bude porovnána v různých ředěních, aby se určila přesnost (očekávaná AF vs. pozorovaná AF), přesnost (variace AF mezi replikáty) a nejnižší dosažitelný limit detekce. Pro testování reprodukovatelnosti testu při jeho zamýšleném klinickém použití bude sekvenování opakováno na 30 použitých vzorcích Cíl 1, který bude zahrnovat širokou škálu nádorových MAF. Sponzor vypočítá variační koeficient mezi replikáty. Na základě pilotních studií Sponzor předpokládá vynikající reprodukovatelnost (CV<5%). Cíl 3. Sběr vzorků. Odběr vzorků navržených ve fázi II bude zahájen v každé zúčastněné instituci se souhlasem příslušného IRB/Etického výboru.

Po odběru jsou vzorky odeslány do Institutu pro výzkum rakoviny na Lékařské univerzitě ve Vídni, který provede UtL filtraci a extrakci DNA.

Bude také extrahována párová DNA z Pap nátěrů a periferních leukocytů. Izolovaným DNA bude přiděleno identifikační číslo a odeslány společnosti TwinStrand pro duplexní sekvenování.

Milníky fáze I:

1. Potvrďte užitečnost UtL filtrace na obohacení mutací nádoru.
2. Kvantifikujte přesnost, přesnost, spodní mez detekce a reprodukovatelnost na UtL.
3. Zahajte odběr vzorků pro fázi II.

Produkty fáze I:

1. Pracovní postup DS připravený pro aplikaci na UtL DNA v komerčním měřítku ve fázi II a fázi III.
2. Vzorová banka pro fázi II

PŘÍSTUP FÁZE II Fáze II ověří použití TP53 DS na UtL pro časnou detekci rakoviny vaječníků v rozšířených kohortách pacientů s kontrolou případů zahrnujících průměrné i vysoce rizikové populace. Předdefinované parametry, které mohou ovlivnit senzitivitu a specificitu frekvence mutace TP53, budou zkoumány a statisticky modelovány. Klinická senzitivita a specifita bude maximalizována vytvořením personalizovaných statistických modelů diagnostického prahu využívajících mnohorozměrné klinické charakteristiky, stejně jako jedinečné zatížení pozadí mutací každého jednotlivce na základě sekvenování leukocytů. U podskupiny pacientů bude potvrzena lepší účinnost UtL oproti odběru Pap stěru. Kromě toho bude u podskupiny zahrnutých pacientů provedena studie proof of concept za účelem studia sady 96 methylačních markerů relevantních pro HGSC v UtL a odpovídající nádorové tkáni/STIC.

CÍL 1. OBECNÝ SCREENING KARCINY OVARIA V POPULACE Tento cíl vyvinout biomarker pro detekci HGSC v průměrné rizikové populaci. Sponzor provede případovou kontrolní studii, která integruje mutační data TP53 DS s klinickými patologickými informacemi s cílem identifikovat ženy s HGSC s maximální citlivostí a specificitou. Více než 98 % HGSC nese mutace v TP53, což znamená, že ultra hluboký DS lze nákladově efektivně zaměřit pouze na malou genomickou oblast. Produktem tohoto cíle bude soubor dat biomarkerů pro 200 pacientů, který demonstruje nákladově efektivní a komerčně robustní výkon této kriticky potřebné diagnostiky rakoviny vaječníků.

Cíl 1A: Zhodnotit výkonnost testu TP53 DS na UtL pro detekci HGSC u pacientů s průměrným rizikem.

Metody: Vzorky UtL od 200 subjektů z průměrné rizikové populace budou analyzovány prostřednictvím DS: 100 subjektů s HGSC (případy) a 100 subjektů s lézemi, které byly po resekci nakonec shledány jako benigní, tj. bez rakoviny (kontroly). U všech pacientek bude UtL odebrán před chirurgickým zákrokem pro ovariální masu. Výplach bude proveden během luteální fáze menstruačního cyklu, pokud je před menopauzou. Chirurgické vzorky budou patologicky posouzeny a pacient bude započítán jako HGSC pozitivní nebo jako kontrola v závislosti na histologických výsledcích. U pacientů s rakovinou bude primární nádor sekvenován konvenčními metodami Lékařské univerzity ve Vídni pro panel genů, který zahrnuje TP53, BRCA1 a BRCA2. U všech deidentifikovaných vzorků pacientů budou shromážděné klinické informace zahrnovat: věk, kouření v anamnéze, předchozí expozici chemoterapii, paritu, věk menopauzy, věk menarché, historii užívání perorální antikoncepce, rodinnou anamnézu rakoviny a sedm- stav genové mutace primárního nádoru. Případy a kontroly budou věkově přizpůsobeny a bude zahrnuto co nejširší věkové rozmezí, aby bylo možné posoudit vliv věku na senzitivitu a specificitu.

Statistická analýza: Podrobný profil mutace pro každý vzorek bude generován z výstupních souborů duplexního sekvenování včetně: frekvence mutovaných alel (MAF) pro všechny mutované pozice, spektra mutací, předpokládané patogenity k funkci proteinu, vztahu ke známým aktivním bodům a celkové mutační zátěži (počet mutantních nukleotidů dělený celkovým počtem sekvenovaných nukleotidů). Poté budou vzorky odslepeny pro stav případů-kontrol. TP53 MAF z DNA odebrané UtL bude použit jako prediktor pro rozlišení pacientů s průměrným rizikem (AIM I) s a bez HGSC pomocí logistického regresního modelování. Věk, kuřácká anamnéza, předchozí expozice chemoterapii, parita, věk menopauzy, věk menarché, anamnéza užívání perorální antikoncepce, rodinná anamnéza rakoviny a stav zárodečných mutací budou považovány za potenciální zmatky. Predikce modelu bude posouzena křížovou validací. Analogická analýza bude aplikována na skupinu vysoce rizikových pacientů (AIM II), kde přítomnost a absence STIC definuje výslednou proměnnou. V obou případech budou navrženy mezní hodnoty frekvence mutantních alel a bude odhadnuta specificita a senzitivita včetně vhodných intervalů spolehlivosti.

Cíl 1B: Zlepšení diagnostického výkonu pomocí personalizované kalibrace pomocí zátěže mutací na pozadí.

Bezprecedentní citlivost DS nás vedla k novému objevu, že mutace podobné rakovině se s věkem hromadí na velmi nízkých úrovních v mnoha lidských tkáních. V pilotní studii sponzor zjistil, že průměrná zátěž mutací BB je poněkud vyšší v UtL než v jiných tkáních, potenciálně kvůli příspěvku DNA z endometriální tkáně, která se extenzivně replikuje před menopauzou. I když to neohrozilo specificitu pilotní studie, zadavatel uznává, že BB by mohla představovat překážku u některých velmi časných nádorů, kde je signál MAF nízký, nebo u velmi starších žen, kde je pozadí vysoké. Sponzor očekává, že lavážní filtrace a sběr luteální fáze u premenopauzálních žen sníží signál BB, ale jako další opatření bude sponzor zkoumat, zda lze výkon dále zlepšit normalizací pro zátěž mutací pozadí jedince. Zadavatel předpokládá, že hladina mutací TP53 v cirkulujících leukocytech může sloužit jako empiricky měřený osobní kalibrátor, který zachycuje nejen známé faktory zvyšující BB, jako je věk, ale také neznámé mutagenní expozice nebo jiné faktory vyskytující se během života člověka. Ačkoli DNA z leukocytů pravděpodobně přispívá pouze minimálním množstvím k celkovému fondu BB mutací v UtL, sponzor předpokládá, že mohou sloužit jako pověstný „kanárek v uhelném dole“, který bude proporcionálně reprezentovat BB mutace jinde v těle. Zátěž BB mutací v laváži sama o sobě nemůže být přímo měřena v podmínkách reálného světa, když mutace přispívající nádorem nejsou známy. Věrohodnost tohoto konceptu ukázala naše počáteční studie mutací TP53 v peritoneální tekutině, která zahrnovala podskupinu odpovídajících krevních vzorků a ukázala silnou souvislost mezi BB a věkem.

Metody: DNA ze složky mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) - odebrané bezprostředně před operací - náhodně vybraných 50 ze 100 případů HGSC a 50 ze 100 kontrol z cíle 1A bude extrahována a podrobena TP53 DS na ~10 000x molekulární hloubka. Mutace TP53 z PBMC budou odečteny od mutací TP53 nalezených v UtL.

Statistická analýza: Sponzor bude zkoumat souvislost mezi frekvencemi mutace TP53 v UtL a leukocytech a určí, zda falešně negativní v cíli 1A odpovídají případům se zvýšeným BB v leukocytech. Kromě toho bude sponzor analyzovat frekvence mutace TP53 v leukocytech jako prediktor stavu kontroly případu, opět pomocí postupu vynechání 10 %. Tato inovativní kalibrační metoda bude porovnána s jednoduchými metrikami ROC dosaženými s jednorozměrným modelem využívajícím fixní mutační frakci a také s upraveným vícerozměrným modelem vyvinutým na základě jiných charakteristik pacienta, jako je věk. Jako vědecká otázka nesouvisející se současnými cíli sponzor netrpělivě očekává, zda mutační zátěž leukocytů TP53 bude sloužit jako nezávislý prediktor věku pacienta, celkového zdraví nebo historie mutagenních expozic.

Cíl 1C. Porovnání diagnostického výkonu děložní laváže vs. DNA odebrané Pap stěrem.

První zpráva o použití NGS pro detekci rakoviny vaječníků z transvaginální tekuté biopsie se opírala o odběr Pap stěru a SafeSeqS jako technologii sekvenování. Citovaná citlivost 41 % poskytla důležitý důkaz principu, ale také dostatečný prostor pro zlepšení. Sponzor definitivně prokázal vynikající přesnost DS oproti metodám podobným SafeSeqS a probíhající studie v naší laboratoři naznačují omezenou citlivost Pap nátěrů ve srovnání s UtL. Zbývá však provést přímé srovnání dvou metod odběru u stejných pacientů. Formální prokázání stupně nadřazenosti UtL nad Pap stěry pomůže při komerčním vstupu na trh (sponzor poznamenává, že související NCI SBIR byla udělena PapGene Inc, společnosti založené autory výše zmíněné studie). Převaha UtL se očekává na základě skutečnosti, že výplachy se dostanou do vejcovodů a povrchů vaječníků, zatímco Pap stěry se spoléhají na diseminované rakovinné buňky, které se dostanou do cervikálního kanálu. Nicméně v případě, že TP53 DS na Pap nátěrech nebude mít drastickou nižší výkonnost UtL, sponzor by tuto doplňkovou metodu odběru dále prozkoumal. Vzhledem k tomu, že Pap stery běžně provádějí poskytovatelé primární péče, možnost jejich použití by mohla pomoci urychlit přijetí na trh. Současné důkazy však ukazují na pravděpodobnou podřadnost Pap stěrů.

Metody: Sponzor provede TP53 DS, jak je uvedeno výše, ale s použitím DNA z Pap nátěrů odebraných před operací náhodně vybrané, věkově odpovídající podskupiny 25 případů rakoviny a 25 kontrol z cíle 1A.

Statistická analýza: Údaje o TP53 MAF z DNA shromážděné konvenčními testy Pap stěr od podvzorku pacientů s průměrným rizikem budou považovány za další prediktor v modelech vyvinutých v rámci cíle 1A a 1B. Zadavatel prozkoumá, zda existuje nějaká další pravomoc rozlišovat případy od kontrol lze získat kombinací informací z Pap stěrů a UtL.

CÍL 2. VYSOKÉ RIZIKOVÉ SKREENING KARCINOMU OVARIÍ Tento cíl bude mít podobný přístup jako Cíl 1, ale zaměří se na ženy s vysokým rizikem rakoviny vaječníků v důsledku dědičných mutací rakoviny prsu a vaječníků (HBOC). HBOC ženy budou identifikovány silnou rodinnou anamnézou rakoviny prsu nebo vaječníků a bylo zjištěno, že nesou mutace v genech náchylnosti k rakovině, obvykle BRCA1 a BRCA2, které propůjčují celoživotní riziko HGSC 35 %, 46 % a 13 %, 23 %, respektive. Standardní péče je salpingo ooforektomie (RRSO) snižující riziko v raném věku, typicky po dokončení porodu. Ačkoli tento přístup snižuje úmrtnost, je nedokonalý: přibližně 10 % rakoviny vaječníků v této populaci se vyvine před dosažením věku 40 let. Ve vídeňské sérii případů byly rakoviny pozorovány již ve věku 20 let, což je mnohem dříve, než by byla normálně provedena profylaktická operace. I při standardní péči jsou tedy ženy s HBOC v reprodukčním věku vystaveny významně zvýšenému riziku rakoviny vaječníků ve srovnání s jinými ženami, jejich potřeba účinného screeningového nástroje je ještě větší. V současnosti se musí postižené ženy rozhodnout, že buď přijmou zvýšené riziko vysoce smrtelné rakoviny, nebo se rozhodnou zapomenout (nebo předčasně ukončit) porod. Toto je nesnesitelně náročné rozhodnutí, kterému čelí stovky tisíc žen jen v USA. U určitých etnických skupin, zejména aškenázských Židů, je riziko přenašečství až 1 ze 40. Přesto u většiny přenašečů BRCA, dokonce i u těch, kteří nepodstoupili operaci, se HGSC nikdy nevyvine. Existuje naléhavá potřeba včasných diagnostických nástrojů u žen s vysokým rizikem HGCS, aby bylo možné zachránit životy a zachovat možnost volby plodnosti. Produktem tohoto cíle bude soubor dat biomarkerů pro 115 pacientů, který demonstruje komerčně robustní výkon takového testu.

Cíl 2A. Posoudit výkonnost testu TP53 DS na UtL pro detekci HGSC u vysoce rizikových pacientů.

Zadavatel přistoupí k této studii podle obecných metod Cíle 1A. Jeden významný rozdíl je v tom, že UtL bude shromažďován od žen HBOC podstupujících RRSO, spíše než od žen se známými ovariálními masami. Po RRSO procházejí vaječníky a vejcovody pečlivým protokolem řezů známým jako SEE-FIM, aby se pečlivě prozkoumaly tkáně, zejména fimbrie, na STIC a okultní rakoviny. V této vysoce rizikové populaci se takové léze nacházejí zhruba u 5 % resekcí. Skupina s rakovinou bude zahrnovat ženy, kde byly během SEE-FIM nalezeny STIC nebo okultní nádory, kontrolní skupina bude zahrnovat ženy bez lézí. Tento design studie je inovativní v tom, že se zaměřuje nejen na vysoce rizikové ženy, ale konkrétně na schopnost našeho testu detekovat velmi rané stádium, potenciálně i mikroskopické, rakoviny, když zůstávají chirurgicky léčitelné.

Metody: Vzorky UtL od až 115 žen s hereditárním vysoce rizikovým syndromem rakoviny vaječníků budou analyzovány pomocí DS: 15 s STIC nebo okultní rakovinou (případy) a až 100 bez rakoviny (kontroly). Pouzdro a ovládání budou odpovídat věku. UtL budou provedeny bezprostředně před RRSO. Chirurgické vzorky budou patologicky hodnoceny centrálně standardizovaným protokolem SEE-FIM. Po RRSO procházejí vaječníky a vejcovody pečlivým protokolem řezů známým jako SEE-FIM, aby se pečlivě prozkoumaly tkáně, zejména fimbrie, na STIC a okultní rakoviny. Zadavatel očekává, že v této kohortě identifikoval 5 až 15 žen s STIC nebo okultní rakovinou, 100 žen stejného věku nebude mít žádné zjištěné léze. Menší počet případů rakoviny než u kontrol odráží nízké procento operací pozitivních na léze a počet vzorků, kterých je sponzorský projekt reálně schopen dosáhnout. Ačkoli by byl optimální větší počet, takové vzorky jsou extrémně omezené. Skupina s rakovinou bude zahrnovat ženy, kde byly během SEE-FIM nalezeny STIC nebo okultní HGSC, kontrolní skupina bude zahrnovat ženy bez lézí Statistická analýza: Bude to podle cíle 1A.

Cíl 2B. Kalibrace diagnostického prahu u vysoce rizikových žen podle zátěže mutace pozadí.

Tento dílčí cíl bude používat stejný protokol a statistické metody cíle 1B a aplikuje je na vysoce r i s k populaci cíle 2.

Metody: Bude hodnocena leukocytová DNA ze všech dostupných případů rakoviny a náhodně vybrané 30členné podskupiny žen z kontrolní skupiny. Je dobře známo, že riziko malignity u žen s HBOC je ve srovnání s ostatními vyšší v důsledku defektů v opravě DNA, které zvyšují pravděpodobnost vzniku onkogenních mutací. Sponzor jako takový předpokládá, že zátěž mutací pozadí neodvozených z rakoviny měřená v UtL i v periferní krvi může být také úměrně zvýšena. Pro zvýšení specifity v této skupině může být zvláště důležité přizpůsobení vysoké zátěži mutacemi pozadí měřené v krvi.

Statistická analýza: Bude to v souladu s cílem 1B.

CÍL III Definovat methylační signaturu pro detekci HGSC v UtL. Za posledních 15 let byla prokázána hodnota analýzy metylace DNA pro detekci epigenetických, nádorově specifických změn, zejména v diagnostice rakoviny. Studie metylace DNA u rakoviny vaječníků (OC) se zaměřily na detekci fragmentů DNA uvolněných OC buňkami do krevního řečiště (tj. bezbuněčná DNA - cfDNA) naznačují, že vzory metylace DNA v cfDNA mají potenciál detekovat část OC až dva roky před diagnózou. Tato studie také jasně ukazuje omezení tohoto přístupu, protože pouze 50 % všech pacientek, u kterých se během dvou let nakonec vyvinul serózní ovariální karcinom vysokého stupně (HGSC), bylo možné detekovat. Základním problémem je, že kvůli nízké koncentraci cfDNA v krevním řečišti je potřeba detekovat velmi slabý signál. S cílem potenciálního zvýšení citlivosti detekce HGSC provede zadavatel ve spolupráci s prof. Andreasem Weinhäuselem, Rakouským technologickým institutem (AIT), Kompetenční jednotka Molekulární diagnostika, studii proof of concept u podskupiny pacientů zařazených do tento projekt. Prof. Andreas Weinhäusel identifikoval 96 methylačních markerů relevantních pro HGSC. K methylaci DNA je zapotřebí pouze velmi malé množství DNA. Pro další vývoj specifičnosti a citlivosti testovacího postupu je proto vhodné použít již dostupnou DNA z výplachů a odpovídající nádorovou tkáň, která byla extrahována v průběhu této studie. Produktem AIM3 bude soubor dat methylačních markerů pro 140 pacientů, který demonstruje vysoce citlivou účinnost takového testu.

Metody: Genomová DNA z UtLs a odpovídající nádorová tkáň od 30 pacientů s HGSC a 10 STIC/okultních karcinomů budou obohaceny o metylovanou DNA pomocí metylačně citlivých restrikčních enzymů. Tato DNA bude analyzována provedením high-through put-qPCR, ve kterém bude paralelně analyzováno 5 x 96 markerů x 96 DNA. Nejinformativnější markery budou spojeny do methylačního podpisu. K prokázání specifičnosti podpisové DNA z UtL bude analyzováno 60 kontrol (30 případů průměrného rizika a 30 případů vysokého rizika). Posouzení vzoru metylace DNA bude provedeno na předresekčních výplachech a až na 10 STIC lézích/okultních karcinomech. Když výsledky lokální patologie identifikují STIC nebo okultní rakovinné buňky (tkáň FFPE), provede se laserová mikrodisekce a izolace DNA. Následně bude provedena aplikace standardního sekvenování NGS TP53, jak je popsáno v AIM 1 a AIM 2. V této pilotní dílčí studii bude na zbývající materiál DNA aplikována high-through put-qPCR pro posouzení metylačního stavu.

Statistická analýza: S cílem vyhodnotit potenciál pro definování podpisu methylace DNA pro jednoduché testování PCR budou hodnoty dCT-PCR z 96-plexní vysoce výkonné analýzy MSREqPCR analyzovány bioinformatikou a biostatistikou, aby bylo možné provést 1) srovnání tříd mezi relevantními klinickými výsledky. podtypy a třídy pro definování významně odlišně metylovaných genů; 2) multivariační třídní predikční analýza využívající různé přístupy k výběru vlastností založené na p-hodnotách jednoho markeru. Různé klasifikační algoritmy (např. k-nejbližší soused, stroje s podpůrným vektorem, lineární diskriminační analýzy atd.) s použitím 10násobné křížové validace a/nebo křížové validace s vynecháním jedné pro výběr nejlepších kandidátních methylačních markerů - a algoritmů; kromě toho budou nejvyšší hodnoty AUC jednotlivých kandidátních methylačních markerů definovány v ROC analýze a zohledněny pro výběr markeru.

Podmnožina 48 kandidátních markerů bude vybrána pro potvrzení v samostatné sadě vzorků. Z toho odvozená methylační data budou analyzována pomocí porovnání tříd a analýzy predikce tříd podobným způsobem jako první soubor dat odvozených z 480 plexní analýzy. Budou definovány nejlépe fungující jednotlivé markery a kombinace markerů z vícerozměrné analýzy. Výsledky klasifikace a metylační data budou porovnány s výsledky testu mutace p53, aby se vyhodnotil potenciál diagnostické klasifikace založené na metylaci, a to jako jediné a v kombinaci s analýzou mutace p53. To bude provedeno za použití různých přístupů předpovědi tříd integrujících jak p53, tak methylační data v multivariačních modelech.