Раннее выявление рака яичников высокой степени злокачественности с использованием исследования EHUD для лаважа матки и дуплексного секвенирования (EHUD)

ПОДХОД, ФАЗА I Вашингтонский университет продемонстрировал диагностическое доказательство принципа; однако для развертывания в промышленных масштабах требуется дальнейшая оптимизация и проверка. На этапе I будет оптимизирован метод фильтрации UTL (цель 1), подтверждена аналитическая эффективность коммерческого рабочего процесса (цель 2) и достигнут этап сбора проб (цель 3). Цель 1. Определить полезность фильтрации маточного лаважа для максимального обогащения ДНК, полученной из опухоли. Предварительное тестирование с двумя образцами показало, что фильтрация UtL для удаления скоплений эндометриальных клеток может увеличить чувствительность к опухолевым мутациям в несколько раз. Этот набор данных будет расширен путем анализа эффекта фильтрации в 10 UtL от пациентов с HGSC с известными мутациями TP53. Каждый UtL будет разделен пополам: первая половина будет отфильтрована, а вторая останется неотфильтрованной. ДНК будет извлечена из отфильтрованных, фильтратных и нефильтрованных фракций и проанализирована с помощью TP53 DS (всего 30 образцов). Для каждого UtL будет сравниваться выход ДНК в каждой из фракций и MAF опухолевой мутации. Ожидается, что отфильтрованная фракция будет содержать меньше ДНК, чем неотфильтрованная фракция, но опухолевая мутация будет присутствовать с большей частотой. Если чувствительность улучшится (т. е. больше будет получено за счет обогащения, чем потеряно за счет уменьшения из менее доступной ДНК), фильтрация будет использоваться для всех будущих собранных образцов. Цель 2. Валидация оптимизированного анализа: правильность, прецизионность, предел обнаружения и воспроизводимость. Компания TwinStrand разработала оптимизированный рабочий процесс DS с использованием улучшенных адаптеров, химии лигирования и высокопроизводительного формата на основе 96-луночных планшетов, подходящего для роботов для работы с жидкостями и совместимого с лабораторными стандартами CLIA.

TwinStrand также разработал оптимизированный облачный конвейер анализа, который поддерживает автоматическую параллельную обработку нескольких образцов. Будет проверен оптимизированный процесс обнаружения мутаций TP53 в образцах UtL. Для оценки точности, технической прецизионности и нижнего предела обнаружения образцы ДНК от двух индивидуумов, отличающихся по генотипу более чем на 5 сайтов SNP в TP53 или рядом с ним, будут смешаны в соотношении от 1:100 до 1:5000, два UtL. Смеси будут секвенированы на ~10 000-кратной молекулярной глубине в двух независимых экспериментах. Фракции аллелей SNP (AF) будут сравниваться при различных разведениях для определения точности (ожидаемый AF против наблюдаемого AF), прецизионности (изменчивость AF среди повторов) и наименьшего достижимого предела обнаружения. Чтобы проверить воспроизводимость анализа при его предполагаемом клиническом использовании, секвенирование будет повторено на 30 образцах, используемых в цели 1, которая будет охватывать широкий спектр опухолевых MAF. Спонсор рассчитает коэффициент вариации среди повторов. На основе пилотных исследований Спонсор ожидает превосходную воспроизводимость (CV<5%). Цель 3. Сбор проб. Сбор образцов, предложенных на Фазе II, будет начат после соответствующего одобрения ЭСО/Этического комитета в каждом участвующем учреждении.

После сбора образцы отправляются в Институт исследования рака Венского медицинского университета, который проведет UTL-фильтрацию и экстракцию ДНК.

Также будет извлечена парная ДНК из мазков Папаниколау и периферических лейкоцитов. Выделенным ДНК будет присвоен идентификационный номер, и они будут отправлены в TwinStrand для дуплексного секвенирования.

Этапы I этапа:

1. Подтвердите полезность фильтрации UtL для обогащения опухолевых мутаций.
2. Количественно определите точность, прецизионность, нижний предел обнаружения и воспроизводимость упрощенного анализа на UTL.
3. Начать сбор образцов для Фазы II.

Продукты фазы I:

1. Рабочий процесс DS готов к применению к ДНК UtL в коммерческом масштабе на этапах II и III.
2. Банк образцов для Фазы II

ПОДХОД, ЭТАП II На этапе II будет подтверждено использование TP53 DS на UtL для раннего выявления рака яичников в расширенных когортах пациентов с методом случай-контроль, охватывающих как группы среднего, так и высокого риска. Предварительно определенные параметры, которые могут повлиять на чувствительность и специфичность частоты мутаций TP53, будут изучены и смоделированы статистически. Клиническая чувствительность и специфичность будут максимальными за счет создания персонализированных статистических моделей диагностического порога с использованием многомерных клинических характеристик, а также уникальной фоновой мутационной нагрузки каждого человека на основе секвенирования лейкоцитов. В подгруппе пациентов будет подтверждено превосходство UTL над взятием мазка Папаниколау. Кроме того, в подгруппе включенных пациентов будет проведено исследование для подтверждения концепции для изучения набора из 96 маркеров метилирования, имеющих отношение к HGSC в UtL и соответствующих опухолевых тканях/STIC.

ЦЕЛЬ 1. СКРИНИНГ РАКА ЯИЧНИКОВ В ОБЩЕЙ НАСЕЛЕННОСТИ Эта цель заключается в разработке биомаркера для обнаружения HGSC в популяции со средним риском. Спонсор проведет исследование случай-контроль, в котором данные о мутациях TP53 DS будут объединены с клинической патологической информацией, чтобы идентифицировать женщин с HGSC с максимальной чувствительностью и специфичностью. Более 98% HGSCs несут мутации в TP53, а это означает, что сверхглубокая DS может быть экономически эффективно сосредоточена только на небольшой области генома. Результатом этой цели станет набор данных о биомаркерах для 200 пациентов, который демонстрирует рентабельную и коммерчески надежную работу этой критически необходимой диагностики рака яичников.

Цель 1A: оценить эффективность теста TP53 DS на UtL для обнаружения HGSC у пациентов со средним риском.

Методы: образцы UtL от 200 субъектов из популяции среднего риска будут проанализированы с помощью DS: 100 субъектов с HGSC (случаи) и 100 субъектов с поражениями, которые в конечном итоге оказались доброкачественными после резекции, т. е. без рака (контроль). У всех пациенток UtL будет собираться до хирургического вмешательства по поводу новообразования яичника. Лаваж будет проводиться во время лютеиновой фазы менструального цикла в пременопаузе. Хирургические образцы будут оценены патологически, и пациент будет считаться положительным HGSC или контролем в зависимости от результатов гистологического исследования. Для больных раком первичная опухоль будет секвенирована с помощью обычных методов Медицинским университетом Вены для панели генов, которая включает TP53, BRCA1 и BRCA2. Для всех деидентифицированных образцов пациентов собранная клиническая информация будет включать: возраст, историю курения, предшествующее воздействие химиотерапии, паритет, возраст менопаузы, возраст менархе, историю использования оральных контрацептивов, семейный анамнез рака и семь- мутационный статус гена первичной опухоли. Случаи и контрольные группы будут соответствовать возрасту, и будет включен как можно более широкий возрастной диапазон для оценки влияния возраста на чувствительность и специфичность.

Статистический анализ: Подробный профиль мутации для каждого образца будет создан из выходных файлов дуплексного секвенирования, включая: частоту мутантных аллелей (MAF) для всех мутантных позиций, спектр мутаций, предполагаемую патогенность для функции белка, отношение к известным горячим точкам и общую мутационную нагрузку. (количество мутантных нуклеотидов, деленное на общее количество секвенированных нуклеотидов). После этого образцы будут расшифрованы для статуса контрольных случаев. TP53 MAF из ДНК, собранной UtL, будет использоваться в качестве предиктора для дифференциации пациентов со средним риском (AIM I) с HGSC и без него с помощью моделирования логистической регрессии. Возраст, история курения, предшествующее воздействие химиотерапии, паритет, возраст менопаузы, возраст менархе, история использования оральных контрацептивов, семейный анамнез рака и статус мутации зародышевой линии будут рассматриваться как потенциальные вмешивающиеся факторы. Предсказание модели будет оцениваться перекрестной проверкой. Аналогичный анализ будет применен к группе пациентов с высоким риском (AIM II), где наличие или отсутствие STIC определяет переменную исхода. В обоих случаях будут предложены пороговые значения для частоты мутантных аллелей, а специфичность и чувствительность будут оценены, включая соответствующие доверительные интервалы.

Цель 1B: Улучшение диагностической эффективности с помощью персонализированной калибровки по нагрузке фоновых мутаций.

Беспрецедентная чувствительность СД привела нас, а затем и других, к новому открытию, что ракоподобные мутации с возрастом накапливаются в очень малых количествах во многих тканях человека. В пилотном исследовании спонсор обнаружил, что средняя нагрузка мутаций BB несколько выше в UtL, чем в других тканях, возможно, из-за вклада ДНК из ткани эндометрия, которая интенсивно реплицируется до менопаузы. Хотя это не повлияло на специфичность пилотного исследования, спонсор признает, что BB может представлять собой препятствие для некоторых очень ранних опухолей, у которых сигнал MAF низкий, или у очень пожилых женщин, у которых высокий фон. Спонсор ожидает, что лаважная фильтрация и сбор лютеиновой фазы у женщин в пременопаузе снизят сигнал BB, но в качестве дополнительной меры спонсор изучит, можно ли улучшить показатели путем нормализации индивидуальной фоновой мутационной нагрузки. Спонсор предполагает, что уровень мутаций TP53 в циркулирующих лейкоцитах может служить эмпирически измеренным личным калибратором, который фиксирует не только известные факторы, повышающие BB, такие как возраст, но также неизвестные мутагенные воздействия или другие факторы, возникающие в течение жизни человека. Хотя ДНК из лейкоцитов, вероятно, вносит лишь минимальный вклад в общий пул мутаций BB в UtL, спонсор утверждает, что они могут служить пресловутой «канарейкой в ​​​​угольной шахте», которая будет пропорционально репрезентативной для мутаций BB в других частях тела. Сама по себе мутационная нагрузка BB в лаваже не может быть непосредственно измерена в реальных условиях, когда неизвестны мутации, вызванные опухолью. Правдоподобие этой концепции было продемонстрировано нашим первоначальным исследованием мутаций TP53 в перитонеальной жидкости, которое включало подмножество соответствующих образцов крови и указывало на сильную связь между BB и возрастом.

Методы: ДНК из компонента мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), собранного непосредственно перед операцией, у случайно выбранных 50 из 100 случаев HGSC и 50 из 100 контролей из Цели 1A будет извлечена и подвергнута TP53 DS при ~10 000x молекулярном уровне. глубина. Мутации TP53 из PBMC будут вычтены из мутаций TP53, обнаруженных в UtL.

Статистический анализ: Спонсор изучит связь между частотами мутаций TP53 в UtL и лейкоцитах и ​​определит, соответствуют ли ложноотрицательные результаты в Aim 1A случаям с повышенным BB в лейкоцитах. Кроме того, спонсор проанализирует частоту мутаций TP53 в лейкоцитах в качестве предиктора статуса контрольного случая, снова используя процедуру исключения 10%. Этот инновационный метод калибровки будет сравниваться с простыми показателями ROC, полученными с помощью одномерной модели с использованием фиксированной доли мутаций, а также скорректированной многомерной моделью, разработанной на основе других характеристик пациента, таких как возраст. Поскольку это научный вопрос, не связанный с настоящими целями, спонсор хочет увидеть, будет ли лейкоцитарная мутационная нагрузка TP53 служить независимым предиктором возраста пациента, общего состояния здоровья или мутагенных воздействий в анамнезе.

Цель 1С. Сравнение диагностической эффективности промывания матки и ДНК, собранной с помощью мазка Папаниколау.

Первый отчет об использовании NGS для обнаружения рака яичников с помощью трансвагинальной жидкой биопсии основывался на сборе мазка Папаниколау и SafeSeqS в качестве технологии секвенирования. Упомянутая чувствительность в 41 % является важным подтверждением принципа, но также дает достаточно возможностей для улучшения. Спонсор окончательно продемонстрировал более высокую точность DS по сравнению с методами, подобными SafeSeqS, и текущие исследования в нашей лаборатории указывают на ограниченную чувствительность мазков Папаниколау по сравнению с UtL. Однако прямое сравнение двух методов сбора данных у одних и тех же пациентов еще предстоит провести. Формальная демонстрация степени превосходства UtL над мазками Папаниколау поможет выйти на коммерческий рынок (спонсор отмечает, что соответствующий NCI SBIR был присужден PapGene Inc, компании, основанной авторами вышеупомянутого исследования). Ожидается превосходство UtL на основании того факта, что лаважи достигают фаллопиевых труб и поверхностей яичников, тогда как мазки Папаниколау основаны на диссеминированных раковых клетках, достигающих цервикального канала. Тем не менее, в случае, если TP53 DS на мазках Папаниколау не будет значительно хуже UtL, спонсор продолжит изучение этого дополнительного метода сбора. Поскольку мазки Папаниколау обычно выполняются поставщиками первичной медико-санитарной помощи, возможность их использования может помочь ускорить внедрение на рынке. Однако текущие данные указывают на возможную неполноценность мазка Папаниколау.

Методы: Спонсор проведет TP53 DS, как указано выше, но с использованием ДНК из мазков Папаниколау, собранных до операции у случайно выбранной возрастной подгруппы из 25 больных раком и 25 контролей из Цели 1A.

Статистический анализ: данные о MAF TP53 из ДНК, собранной с помощью обычных тестов мазка Папаниколау из подвыборки пациентов со средним риском, будут рассматриваться в качестве дополнительных предикторов в моделях, разработанных в рамках целей 1A и 1B. можно получить, комбинируя информацию из мазка Папаниколау и UTL.

ЦЕЛЬ 2. СКРИНИНГ НА РАК ЯИЧНИКОВ ПОПУЛЯЦИИ С ВЫСОКИМ РИСКОМ Эта цель будет использовать подход, аналогичный цели 1, но будет сосредоточена на женщинах с высоким риском развития рака яичников из-за мутаций наследственного рака молочной железы и рака яичников (HBOC). Женщины с HBOC будут идентифицированы по семейному анамнезу рака молочной железы или яичников и обнаружены как носители мутаций в генах предрасположенности к раку, обычно BRCA1 и BRCA2, которые придают пожизненный риск HGSC 35%, 46% и 13%, 23%, соответственно. Стандартом лечения является сальпингоофорэктомия, снижающая риск (RRSO) в раннем возрасте, как правило, после завершения деторождения. Хотя этот подход снижает смертность, он несовершенен: примерно 10% случаев рака яичников в этой популяции развиваются в возрасте до 40 лет. В серии случаев в Вене рак наблюдался уже в возрасте 20 лет, то есть задолго до того, как в нормальных условиях была бы предпринята профилактическая операция. Таким образом, даже при стандартном уходе женщины репродуктивного возраста с HBOC подвержены значительно повышенному риску рака яичников по сравнению с другими женщинами, их потребность в эффективном инструменте скрининга еще выше. В настоящее время пострадавшие женщины должны принять решение либо принять повышенный риск высоколетального рака, либо отказаться от деторождения (или преждевременно прекратить его). Это мучительно сложное решение, с которым сталкиваются сотни тысяч женщин только в США. В некоторых этнических группах, особенно у евреев-ашкенази, риск быть носителем достигает 1 из 40. Тем не менее, у большинства носителей BRCA, даже у тех, кто не перенес операцию, никогда не разовьется HGSC. Существует острая необходимость в диагностических инструментах раннего выявления у женщин с высоким риском HGCS, чтобы спасти жизни и сохранить возможность выбора фертильности. Продуктом этой цели будет набор данных биомаркеров 115 пациентов, который демонстрирует коммерчески устойчивую эффективность такого анализа.

Цель 2А. Оценить эффективность теста TP53 DS на UtL для обнаружения HGSC у пациентов с высоким риском.

Спонсор будет подходить к этому исследованию в соответствии с общими методами Цели 1А. Одним существенным отличием является то, что UtL будет собираться у женщин HBOC, перенесших RRSO, а не у женщин с известным образованием яичников. После RRSO яичники и фаллопиевы трубы подвергаются тщательному секционному протоколу, известному как SEE-FIM, для тщательного исследования тканей, особенно фимбрий, на наличие STIC и скрытого рака. Среди этой группы высокого риска такие поражения обнаруживаются примерно в 5% резекций. В группу рака войдут женщины, у которых во время SEE-FIM были обнаружены STIC или скрытые опухоли, в контрольную группу войдут женщины без поражений. Этот дизайн исследования является инновационным, поскольку он фокусируется не только на женщинах с высоким риском, но и, в частности, на способности нашего анализа выявлять очень ранние стадии, потенциально даже микроскопические, раковые заболевания, когда они остаются излечимыми хирургическим путем.

Методы: образцы UtL от 115 женщин с наследственными синдромами рака яичников высокого риска будут проанализированы с помощью DS: 15 с STIC или скрытым раком (случаи) и до 100 женщин без рака (контроль). Случай и контроль будут соответствовать возрасту. UtL будут выполняться непосредственно перед RRSO. Хирургические образцы будут оцениваться на предмет патологии с помощью централизованно стандартизированного протокола SEE-FIM. После RRSO яичники и фаллопиевы трубы подвергаются тщательному секционному протоколу, известному как SEE-FIM, для тщательного исследования тканей, особенно фимбрий, на наличие STIC и скрытого рака. Спонсор предполагает выявить от 5 до 15 женщин с STIC или скрытым раком в этой когорте, у 100 женщин того же возраста не будет обнаружено никаких поражений. Меньшее количество случаев рака, чем в контрольной группе, отражает низкий процент хирургических вмешательств с положительным результатом поражения и количество образцов, которых спонсорский проект реально может достичь. Хотя оптимальным было бы большее количество, таких выборок крайне мало. Группа рака будет включать женщин, у которых во время SEE-FIM были обнаружены STIC или скрытые HGSC, контрольная группа будет включать женщин без поражений. Статистический анализ: это будет соответствовать цели 1A.

Цель 2Б. Калибровка диагностического порога у женщин с высоким риском по фоновой мутационной нагрузке.

Эта подцель будет использовать тот же протокол и статистические методы, что и цель 1B, и применить их к группе высокого риска цели 2.

Методы: будет оцениваться ДНК лейкоцитов из всех имеющихся случаев рака и случайно выбранной подгруппы из 30 женщин из контрольной группы. Хорошо известно, что риск злокачественных новообразований у женщин с HBOC повышен по сравнению с другими в силу дефектов репарации ДНК, которые увеличивают вероятность возникновения онкогенных мутаций. Таким образом, спонсор ожидает, что фоновая мутационная нагрузка, не связанная с раком, измеренная в UtL, а также в периферической крови, также может быть пропорционально увеличена. Поправка на высокую фоновую мутационную нагрузку, измеренную в крови, может быть особенно важной для повышения специфичности в этой группе.

Статистический анализ: это будет соответствовать цели 1B.

ЦЕЛЬ III Определить сигнатуру метилирования для обнаружения HGSC в UtL. За последние 15 лет была продемонстрирована ценность анализа метилирования ДНК для обнаружения эпигенетических опухолеспецифических изменений, особенно в диагностике рака. Исследования метилирования ДНК при раке яичников (РЯ) были сосредоточены на обнаружении фрагментов ДНК, выделяемых клетками РЯ в кровоток (т.е. бесклеточная ДНК — вкДНК) позволяют предположить, что паттерны метилирования ДНК во вкДНК могут обнаруживать часть РЯ за два года до постановки диагноза. Это исследование также ясно показывает ограниченность этого подхода, поскольку только у 50% всех пациенток, у которых окончательно развился высокозлокачественный серозный рак яичников (HGSC) в течение двух лет, можно было обнаружить. Основная проблема заключается в том, что из-за низкой концентрации вкДНК в кровотоке необходимо обнаружить очень слабый сигнал. С целью потенциального повышения чувствительности обнаружения HGSC спонсор в сотрудничестве с профессором Андреасом Вайнхойзелем, Австрийский технологический институт (AIT), компетентное подразделение молекулярной диагностики, проведет исследование для подтверждения концепции в подгруппе пациентов, включенных в этот проект. Профессор Андреас Вайнхойзель идентифицировал 96 маркеров метилирования, имеющих отношение к HGSC. Для метилирования ДНК требуется очень небольшое количество ДНК. Поэтому целесообразно использовать уже имеющуюся ДНК из смывов и соответствующей опухолевой ткани, которая была извлечена в ходе этого исследования, для дальнейшего развития специфичности и чувствительности процедуры тестирования. Результатом AIM3 будет набор данных маркеров метилирования 140 пациентов, который демонстрирует высокую чувствительность такого анализа.

Методы: геномная ДНК из UtL и соответствующая опухолевая ткань от 30 пациентов с HGSC и 10 STIC/скрытых видов рака будет обогащена метилированной ДНК с помощью чувствительных к метилированию ферментов рестрикции. Эта ДНК будет проанализирована путем проведения высокопроизводительной ПЦР, в которой 5 x 96 маркеров x 96 ДНК будут анализироваться параллельно. Наиболее информативные маркеры будут объединены в сигнатуру метилирования. Для подтверждения специфичности сигнатурной ДНК из UtLs из 60 контролей будет проанализирована (30 случаев среднего риска и 30 случаев высокого риска). Оценка характера метилирования ДНК будет проводиться в лаважах перед резекцией и в 10 очагах STIC/скрытом раке. Когда результаты локальной патологии выявляют STIC или оккультные раковые клетки (ткань FFPE), будет выполнена лазерная микродиссекция и выделение ДНК. Впоследствии будет выполнено стандартное секвенирование NGS TP53, как описано в AIM 1 и AIM 2. В этом пилотном субисследовании к оставшемуся материалу ДНК будет применена высокопроизводительная ПЦР для оценки статуса метилирования.

Статистический анализ: с целью оценки возможности определения сигнатуры метилирования ДНК для простого ПЦР значения dCT-PCR из 96-плексного высокопроизводительного анализа MSREqPCR будут проанализированы с помощью биоинформатики и биостатистики для проведения 1) сравнения классов между соответствующими клиническими подтипы и классы для определения значительно дифференциально метилированных генов; 2) анализ прогнозирования многомерного класса с использованием различных подходов к выбору признаков на основе одномаркерных p-значений. Различные алгоритмы классификации (например, k-ближайшего соседа, машины опорных векторов, анализ линейной дискриминации и т. д.) будут применяться с использованием 10-кратной перекрестной проверки и / или перекрестной проверки с исключением одного для выбора лучших маркеров-кандидатов метилирования - и алгоритмов; кроме того, верхние значения AUC маркеров-кандидатов метилирования будут определены в ROC-анализе и учтены при выборе маркера.

Подмножество из 48 маркеров-кандидатов будет выбрано для подтверждения в отдельном наборе образцов. Полученные из них данные о метилировании будут проанализированы с использованием сравнения классов и анализа предсказания классов аналогично первому набору данных, полученных в результате комплексного анализа 480. Будут определены наиболее эффективные отдельные маркеры и комбинации маркеров из многофакторного анализа. Результаты классификации и данные о метилировании будут сравниваться с результатами теста на мутацию p53, чтобы оценить потенциал диагностической классификации на основе метилирования как отдельно, так и в сочетании с анализом мутации p53. Это будет проводиться с использованием различных подходов к прогнозированию классов, объединяющих данные p53 и метилирования в многомерных моделях.