Rilevazione precoce del carcinoma ovarico di alto grado mediante studio EHUD di lavaggio uterino e sequenziamento duplex (EHUD)

APPROCCIO FASE I L'Università di Washington ha dimostrato la prova diagnostica di principio; tuttavia, sono necessarie ulteriori ottimizzazioni e convalide per l'implementazione su scala industriale. Nella Fase I il metodo di filtrazione UtL sarà ottimizzato (Obiettivo 1), le prestazioni analitiche sul flusso di lavoro commerciale convalidate (Obiettivo 2) e una pietra miliare della raccolta del campione raggiunta (Obiettivo 3). Obiettivo 1. Determinare l'utilità della filtrazione del lavaggio uterino per massimizzare l'arricchimento del DNA derivato dal tumore. Test preliminari con due campioni hanno indicato che la filtrazione di UtL per rimuovere gruppi di cellule endometriali potrebbe aumentare la sensibilità per le mutazioni tumorali di diverse pieghe. Questo set di dati verrà ampliato analizzando l'effetto di filtrazione in 10 UtL di pazienti con HGSC con mutazioni note di TP53. Ogni UtL sarà diviso a metà: la prima metà verrà filtrata e la seconda rimarrà non filtrata. Il DNA sarà estratto dalle frazioni filtrate, filtrate e non filtrate e analizzato mediante TP53 DS (totale di 30 campioni). Per ogni UtL, verrà confrontata la resa del DNA in ciascuna delle frazioni e la MAF della mutazione tumorale. Si prevede che la frazione filtrata conterrà meno DNA rispetto alla frazione non filtrata, ma la mutazione del tumore sarà presente con una frequenza maggiore. Se la sensibilità è migliorata (cioè si guadagna di più con l'arricchimento di quanto si perde con la riduzione da meno DNA disponibile), la filtrazione verrà utilizzata su tutti i futuri campioni raccolti. Obiettivo 2. Validazione del saggio ottimizzato: accuratezza, precisione, limite di rivelabilità e riproducibilità. TwinStrand ha sviluppato un flusso di lavoro DS semplificato utilizzando adattatori migliorati, chimica di legatura e un formato basato su piastra a 96 pozzetti ad alta produttività adatto ai robot per la manipolazione dei liquidi e compatibile con gli standard di laboratorio CLIA.

TwinStrand ha inoltre sviluppato una pipeline di analisi basata su cloud ottimizzata che supporta l'elaborazione parallela automatizzata di più campioni. Verrà convalidato il processo ottimizzato per il rilevamento delle mutazioni TP53 nei campioni UtL. Per valutare l'accuratezza, la precisione tecnica e il limite inferiore di rilevamento, i campioni di DNA di due individui che differiscono nel genotipo in >5 siti SNP all'interno o nelle vicinanze di TP53 verranno miscelati, in rapporti da 1:100 a 1:5.000, due UtL. Le miscele saranno sequenziate a ~10.000 volte la profondità molecolare in due esperimenti indipendenti. La frazione allelica SNP (AF) verrà confrontata a diverse diluizioni per determinare l'accuratezza (AF attesa rispetto a AF osservata), la precisione (variazione di AF tra i replicati) e il limite di rilevamento più basso ottenibile. Per testare la riproducibilità del test nell'uso clinico previsto, il sequenziamento verrà ripetuto sui 30 campioni utilizzati per l'obiettivo 1, che comprenderà un'ampia gamma di MAF tumorali. Lo Sponsor calcolerà il coefficiente di variazione tra le repliche. Sulla base di studi pilota Lo Sponsor prevede un'eccellente riproducibilità (CV<5%). Obiettivo 3. Raccolta di campioni. La raccolta dei campioni proposti nella Fase II sarà avviata con l'appropriata approvazione dell'IRB/Comitato etico presso ogni istituzione partecipante.

Dopo la raccolta, i campioni vengono spediti all'Istituto per la ricerca sul cancro presso l'Università medica di Vienna che eseguirà la filtrazione UtL e l'estrazione del DNA.

Verrà inoltre estratto il DNA appaiato da Pap test e leucociti periferici. Ai DNA isolati verrà assegnato un numero di identificazione e spediti a TwinStrand per il sequenziamento duplex.

Pietre miliari della fase I:

1. Confermare l'utilità della filtrazione UtL sull'arricchimento delle mutazioni tumorali.
2. Quantifica l'accuratezza, la precisione, il limite inferiore di rilevamento e la riproducibilità del test semplificato su UtL.
3. Avviare la raccolta dei campioni per la Fase II.

Prodotti di fase I:

1. Flusso di lavoro DS pronto per l'applicazione al DNA UtL su scala commerciale in Fase II e Fase III.
2. Banca campioni per la Fase II

APPROCCIO FASE II La fase II convaliderà l'uso di TP53 DS su UtL per il rilevamento precoce del cancro ovarico in coorti di pazienti caso controllo allargate che comprendono sia popolazioni a rischio medio che ad alto rischio. Saranno esaminati e modellati statisticamente i parametri predefiniti che possono influenzare la sensibilità e la specificità della frequenza delle mutazioni di TP53. La sensibilità e la specificità clinica saranno massimizzate costruendo modelli statistici di soglia diagnostica personalizzati utilizzando caratteristiche cliniche multivariate, nonché il carico di mutazioni di fondo unico di ciascun individuo basato sul sequenziamento dei leucociti. In un sottogruppo di pazienti, sarà confermata la performance superiore del campionamento UtL rispetto al Pap test. Inoltre, uno studio di prova del concetto sarà condotto in un sottogruppo di pazienti inclusi per studiare una serie di 96 marcatori di metilazione rilevanti per HGSC in UtL e corrispondente tessuto tumorale/STIC.

OBIETTIVO 1. SCREENING DEL CANCRO OVARICO DELLA POPOLAZIONE GENERALE Questo obiettivo svilupperà un biomarcatore per il rilevamento di HGSC in una popolazione a rischio medio. Lo Sponsor condurrà uno studio caso controllo che integri i dati mutazionali di TP53 DS con informazioni patologiche cliniche al fine di identificare le donne con HGSC con la massima sensibilità e specificità. Più del 98% degli HGSC porta mutazioni in TP53, il che significa che il DS ultra profondo può essere focalizzato in modo conveniente solo su una piccola regione genomica. Il prodotto di questo obiettivo sarà un set di dati di biomarcatori di 200 pazienti che dimostrerà le prestazioni economicamente vantaggiose e commercialmente solide di questa diagnostica del cancro ovarico di fondamentale importanza.

Obiettivo 1A: valutare le prestazioni del test di TP53 DS su UtL per il rilevamento di HGSC in pazienti a rischio medio.

Metodi: i campioni UtL di 200 soggetti della popolazione a rischio medio saranno analizzati tramite DS: 100 soggetti con HGSC (casi) e 100 soggetti con lesioni che alla fine sono risultate benigne dopo la resezione, cioè senza cancro (controlli). In tutte le pazienti verrà raccolto l'UtL prima dell'intervento chirurgico per una massa ovarica. Il lavaggio verrà effettuato durante la fase luteinica del ciclo mestruale se in pre-menopausa. I campioni chirurgici saranno valutati patologicamente e un paziente sarà considerato positivo per HGSC o controllo a seconda dei risultati istologici. Per i malati di cancro, il tumore primario sarà sequenziato con metodi convenzionali dall'Università di medicina di Vienna per un pannello di geni che include TP53, BRCA1 e BRCA2. Per tutti i campioni di pazienti resi anonimi, le informazioni cliniche raccolte includeranno: età, storia del fumo, precedente esposizione a chemioterapia, parità, età della menopausa, età del menarca, storia dell'uso di contraccettivi orali, storia familiare del cancro e sette- stato di mutazione genica del tumore primitivo. Casi e controlli saranno abbinati per età e sarà inclusa una fascia di età più ampia possibile per valutare l'effetto dell'età sulla sensibilità e specificità.

Analisi statistica: un profilo di mutazione dettagliato per ciascun campione verrà generato dai file di output del sequenziamento duplex, tra cui: frequenza dell'allele mutante (MAF) per tutte le posizioni mutate, spettro di mutazione, patogenicità prevista per la funzione proteica, relazione con hotspot noti e carico di mutazione complessivo (numero di nucleotidi mutanti diviso per il numero totale di nucleotidi sequenziati). Successivamente, i campioni verranno aperti per lo stato casi-controlli. TP53 MAF dal DNA raccolto da UtL sarà utilizzato come predittore per differenziare tra pazienti a rischio medio (AIM I) con e senza HGSC mediante modelli di regressione logistica. L'età, la storia del fumo, l'esposizione precedente alla chemioterapia, la parità, l'età della menopausa, l'età del menarca, la storia dell'uso di contraccettivi orali, la storia familiare del cancro e lo stato della mutazione germinale saranno considerati potenziali fattori di confusione. La previsione del modello sarà valutata mediante convalida incrociata. Un'analisi analoga verrà applicata al gruppo di pazienti ad alto rischio (AIM II) dove la presenza e l'assenza di STIC definisce la variabile di esito. In entrambi i casi saranno suggeriti valori di cut-off per la frequenza dell'allele mutante e saranno stimate la specificità e la sensibilità includendo opportuni intervalli di confidenza.

Obiettivo 1B: migliorare le prestazioni diagnostiche con calibrazione personalizzata in base al carico di mutazioni di fondo.

La sensibilità senza precedenti di DS ha portato noi poi altri alla nuova scoperta che le mutazioni simili al cancro si accumulano a livelli molto bassi con l'età in più tessuti umani. In uno studio pilota lo sponsor ha scoperto che il carico medio di mutazioni BB è un po' più alto nelle UtL rispetto ad altri tessuti, potenzialmente a causa del contributo del DNA del tessuto endometriale, che si replica ampiamente prima della menopausa. Sebbene ciò non abbia compromesso la specificità nello studio pilota, lo sponsor riconosce che BB potrebbe rappresentare un ostacolo con alcuni tumori molto precoci in cui il segnale MAF è basso o con donne molto anziane in cui il background è elevato. Lo sponsor si aspetta che la filtrazione del lavaggio e la raccolta della fase luteinica nelle donne in premenopausa riducano il segnale BB, ma come misura aggiuntiva lo sponsor esaminerà se le prestazioni possono essere ulteriormente migliorate normalizzando il carico di mutazione di fondo di un individuo. Lo sponsor ipotizza che il livello delle mutazioni TP53 nei leucociti circolanti possa servire come calibratore personale misurato empiricamente che cattura non solo i fattori noti che aumentano il BB, come l'età, ma anche esposizioni mutagene sconosciute o altri fattori che si verificano durante la vita di una persona. Sebbene il DNA dei leucociti contribuisca probabilmente solo in minima parte al pool totale di mutazioni BB nelle UtL, lo sponsor ipotizza che possano fungere da proverbiale "canarino in una miniera di carbone" che sarà proporzionalmente rappresentativo delle mutazioni BB in altre parti del corpo. Il carico di mutazione BB in un lavaggio, di per sé, non può essere misurato direttamente in un ambiente reale quando le mutazioni apportate da un tumore sono sconosciute. La plausibilità di questo concetto è stata dimostrata dal nostro studio iniziale sulle mutazioni TP53 nel fluido peritoneale, che includeva un sottoinsieme di campioni di sangue corrispondenti e indicava una forte associazione tra BB ed età.

Metodi: Il DNA dal componente delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) - raccolto immediatamente prima di un intervento chirurgico - di 50 casi scelti a caso da 100 casi di HGSC e 50 da 100 controlli dall'obiettivo 1A sarà estratto e sottoposto a TP53 DS a ~ 10.000x molecolari profondità. Le mutazioni di TP53 da PBMC saranno sottratte dalle mutazioni di TP53 trovate nell'UtL.

Analisi statistica: lo sponsor esaminerà l'associazione tra le frequenze delle mutazioni TP53 in UtL e nei leucociti e determinerà se i falsi negativi nell'obiettivo 1A corrispondono a casi con aumento di BB nei leucociti. Inoltre, lo sponsor analizzerà le frequenze delle mutazioni di TP53 nei leucociti come predittore dello stato di controllo dei casi, sempre utilizzando la procedura del leave out 10%. Questo innovativo metodo di calibrazione verrà confrontato con le semplici metriche ROC ottenute con il modello univariato utilizzando una frazione di mutazione fissa, nonché con il modello multivariato aggiustato sviluppato sulla base di altre caratteristiche del paziente come l'età. Come questione scientifica non correlata agli obiettivi attuali, lo sponsor è ansioso di vedere se il carico di mutazione dei leucociti TP53 servirà come predittore indipendente dell'età del paziente, della salute generale o della storia delle esposizioni mutagene.

Obiettivo 1C. Confronto delle prestazioni diagnostiche del lavaggio uterino rispetto al DNA raccolto dal Pap test.

Il primo rapporto sull'utilizzo di NGS per il rilevamento del cancro ovarico da una biopsia liquida transvaginale si basava sulla raccolta di Pap test e SafeSeqS come tecnologia di sequenziamento. La citata sensibilità del 41% ha fornito un'importante prova di principio, ma anche ampi margini di miglioramento. Lo sponsor ha definitivamente dimostrato l'accuratezza superiore di DS rispetto ai metodi simili a SafeSeqS e gli studi in corso nel nostro laboratorio indicano una sensibilità limitata dei Pap test rispetto a UtL. Tuttavia, resta da eseguire un confronto diretto dei due metodi di raccolta sugli stessi pazienti. Dimostrare formalmente il grado di superiorità dell'UtL rispetto ai Pap test aiuterà con l'ingresso nel mercato commerciale (lo sponsor nota che un relativo SBIR NCI è stato assegnato a PapGene Inc, una società fondata dagli autori dello studio sopra menzionato). La superiorità dell'UtL è prevista in base al fatto che i lavaggi raggiungono le tube di Falloppio e le superfici ovariche, mentre i Pap test si basano su cellule tumorali disseminate che raggiungono il canale cervicale. Tuttavia, nel caso in cui TP53 DS su Pap test non abbia prestazioni drasticamente inferiori a UtL, lo sponsor esplorerebbe ulteriormente questo metodo di raccolta complementare. Poiché i Pap test vengono regolarmente eseguiti dai fornitori di cure primarie, la possibilità di utilizzarli potrebbe contribuire ad accelerare l'adozione da parte del mercato. Tuttavia, le prove attuali indicano la probabile inferiorità dei Pap test.

Metodi: Lo sponsor eseguirà TP53 DS come sopra ma utilizzando il DNA di Pap test raccolti prima dell'intervento chirurgico di un sottogruppo di 25 casi di cancro selezionati in modo casuale e di 25 controlli dall'obiettivo 1A.

Analisi statistica: i dati sulla MAF TP53 dal DNA raccolti mediante pap test convenzionali da un sottocampione di pazienti a rischio medio saranno considerati come predittori aggiuntivi nei modelli sviluppati nell'ambito degli obiettivi 1A e 1B. può essere ottenuto combinando informazioni da Pap test e UtL.

OBIETTIVO 2. SCREENING DEL CANCRO OVARICO DELLA POPOLAZIONE AD ALTO RISCHIO Questo obiettivo avrà un approccio simile a quello dell'obiettivo 1, ma si concentrerà sulle donne ad alto rischio di cancro ovarico a causa di mutazioni ereditarie del cancro al seno e all'ovaio (HBOC). Le donne HBOC saranno state identificate da una forte storia familiare di carcinoma mammario o ovarico e risultate portatrici di mutazioni nei geni di suscettibilità al cancro, solitamente BRCA1 e BRCA2, che conferiscono un rischio di HGSC per tutta la vita del 35%, 46% e 13%, 23%, rispettivamente. Lo standard di cura è la riduzione del rischio di salpingo ovariectomia (RRSO) in tenera età, in genere dopo il completamento della gravidanza. Sebbene questo approccio riduca la mortalità, è imperfetto: circa il 10% dei tumori ovarici in questa popolazione si sviluppa prima dei 40 anni. Nella serie di casi di Vienna, i tumori sono stati osservati all'età di 20 anni, che è molto prima che fosse normalmente intrapresa una chirurgia profilattica. Pertanto, anche con lo standard di cura, le donne HBOC nei loro anni riproduttivi hanno un rischio significativamente elevato di cancro ovarico rispetto ad altre donne, il loro bisogno di uno strumento di screening efficace è ancora maggiore. Al momento, le donne colpite devono prendere la decisione di accettare l'aumento del rischio di un cancro altamente letale o scegliere di dimenticare (o interrompere prematuramente) la gravidanza. Questa è una decisione atrocemente impegnativa affrontata da centinaia di migliaia di donne solo negli Stati Uniti. In alcuni gruppi etnici, in particolare gli ebrei ashkenaziti, il rischio di essere portatori è di 1 su 40. Eppure la maggior parte dei portatori di BRCA, anche quelli che non hanno subito un intervento chirurgico, non svilupperanno mai HGSC. Vi è un urgente bisogno di strumenti diagnostici di diagnosi precoce nelle donne ad alto rischio di HGCS al fine di salvare vite umane e preservare la scelta della fertilità. Il prodotto di questo obiettivo sarà un set di dati di biomarcatori di 115 pazienti che dimostri prestazioni commercialmente solide di tale analisi.

Obiettivo 2A. Per valutare le prestazioni del test di TP53 DS su UtL per il rilevamento di HGSC in pazienti ad alto rischio.

Lo sponsor si avvicinerà a questo studio secondo i metodi generali dell'obiettivo 1A. Una differenza significativa è che UtL sarà raccolto da donne HBOC sottoposte a RRSO, piuttosto che da donne con masse ovariche note. Dopo RRSO, le ovaie e le tube di Falloppio vengono sottoposte a un meticoloso protocollo di sezionamento noto come SEE-FIM per esaminare attentamente i tessuti, in particolare le fimbrie, alla ricerca di STIC e tumori occulti. Tra questa popolazione ad alto rischio, tali lesioni si trovano in circa il 5% delle resezioni. Il gruppo cancro comprenderà donne in cui sono stati trovati STIC o tumori occulti durante SEE-FIM il gruppo di controllo includerà donne senza lesioni. Questo disegno di studio è innovativo in quanto si concentra non solo sulle donne ad alto rischio, ma in particolare sulla capacità del nostro test di rilevare tumori in fase molto precoce, potenzialmente anche microscopici, quando rimangono curabili chirurgicamente.

Metodi: I campioni UtL di un massimo di 115 donne con sindromi ereditarie di cancro ovarico ad alto rischio saranno analizzati tramite DS: 15 con STIC o cancro occulto (casi) e fino a 100 senza cancro (controlli). Caso e controllo saranno abbinati per età. Gli UtL verranno eseguiti immediatamente prima dell'RRSO. I campioni chirurgici saranno valutati patologicamente da un protocollo SEE-FIM standardizzato a livello centrale. Dopo RRSO, le ovaie e le tube di Falloppio vengono sottoposte a un meticoloso protocollo di sezionamento noto come SEE-FIM per esaminare attentamente i tessuti, in particolare le fimbrie, alla ricerca di STIC e tumori occulti. Lo sponsor prevede di aver identificato da 5 a 15 donne con STIC o tumori occulti in questa coorte, 100 donne di pari età non avranno lesioni rilevate. Il minor numero di casi di cancro rispetto ai controlli riflette la bassa percentuale di interventi chirurgici con lesioni positive e il numero di campioni che il progetto sponsor è realisticamente in grado di raggiungere. Sebbene un numero maggiore sarebbe ottimale, tali campioni sono estremamente limitati. Il gruppo del cancro comprenderà le donne in cui sono stati trovati STIC o HGSC occulti durante il SEE-FIM il gruppo di controllo includerà le donne senza lesioni Analisi statistica: Questo sarà come da Obiettivo 1A.

Obiettivo 2B. Calibrazione della soglia diagnostica in donne ad alto rischio in base al carico di mutazioni di fondo.

Questo sottoobiettivo utilizzerà lo stesso protocollo e gli stessi metodi statistici dell'obiettivo 1B e li applicherà alla popolazione ad alto rischio dell'obiettivo 2.

Metodi: sarà valutato il DNA leucocitario di tutti i casi di cancro disponibili e di un sottogruppo di 30 donne scelto a caso del gruppo di controllo. È ben noto che il rischio di malignità nelle donne HBOC è elevato rispetto ad altre in virtù di difetti nella riparazione del DNA che aumentano la probabilità di insorgenza di mutazioni oncogeniche. Pertanto, lo sponsor prevede che anche il carico di mutazioni di fondo non derivate dal cancro misurato nelle UtL e nel sangue periferico possa essere proporzionalmente elevato. La regolazione per l'elevato carico di mutazioni di fondo misurato nel sangue può essere particolarmente importante per aumentare la specificità in questo gruppo.

Analisi statistica: questo sarà come da Aim 1B.

OBIETTIVO III Definire una firma di metilazione per il rilevamento di HGSC nelle UtL. Negli ultimi 15 anni è stato dimostrato il valore dell'analisi della metilazione del DNA per la rilevazione di cambiamenti epigenetici specifici del tumore, in particolare nella diagnostica del cancro. Gli studi sulla metilazione del DNA nel carcinoma ovarico (OC) si sono concentrati sulla rilevazione di frammenti di DNA versati dalle cellule OC nel flusso sanguigno (ad es. cell-free DNA - cfDNA) suggeriscono che i modelli di metilazione del DNA nel cfDNA hanno il potenziale per rilevare una percentuale di OC fino a due anni prima della diagnosi. Questo studio mostra anche chiaramente i limiti di questo approccio perché è stato possibile rilevare solo il 50% di tutti i pazienti che alla fine hanno sviluppato un carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSC) entro due anni. Il problema di fondo è che, a causa della bassa concentrazione di cfDNA nel flusso sanguigno, è necessario rilevare un segnale molto debole. Con l'obiettivo di aumentare potenzialmente la sensibilità del rilevamento di HGSC, lo sponsor, in collaborazione con il Prof. Andreas Weinhäusel, Istituto austriaco di tecnologia (AIT), Unità di competenza Diagnostica molecolare, eseguirà uno studio di prova del concetto in un sottogruppo di pazienti inclusi in questo progetto. Il prof. Andreas Weinhäusel, ha identificato 96 marcatori di metilazione rilevanti per HGSC. Per la metilazione del DNA è necessaria solo una piccolissima quantità di DNA. Si consiglia pertanto di utilizzare il DNA già disponibile dai lavaggi e il corrispondente tessuto tumorale, che è stato estratto nel corso di questo studio, per l'ulteriore sviluppo della specificità e della sensibilità della procedura del test. Il prodotto di AIM3 sarà un set di dati di marcatori di metilazione di 140 pazienti che dimostra prestazioni ad alta sensibilità di tale analisi.

Metodi: Il DNA genomico da UtL e il corrispondente tessuto tumorale da 30 pazienti con HGSC e 10 STIC/cancri occulti verranno arricchiti per il DNA metilato con l'ausilio di enzimi di restrizione sensibili alla metilazione. Questo DNA sarà analizzato eseguendo un highthrough put-qPCR in cui 5 x 96 marker x 96 DNA saranno analizzati in parallelo. I marcatori più informativi saranno combinati con una firma di metilazione. Per dimostrare la specificità della firma DNA da UtLs da 60 controlli sarà analizzato (30 casi a rischio medio e 30 ad alto rischio). La valutazione del pattern di metilazione del DNA sarà effettuata sui lavaggi pre-resezione e su un massimo di 10 lesioni STIC/tumori occulti. Quando i risultati della patologia locale identificano STIC o cellule tumorali occulte (tessuto FFPE), verranno eseguite la microdissezione laser e l'isolamento del DNA. Successivamente l'applicazione del sequenziamento standard NGS TP53 verrà eseguita come descritto in AIM 1 e AIM 2. In questo sottostudio pilota, la qPCR put-high-through verrà applicata al materiale di DNA rimanente per la valutazione dello stato di metilazione.

Analisi statistica: con l'obiettivo di valutare il potenziale per la definizione di una firma di metilazione del DNA per semplici test PCR, i valori dCT-PCR dall'analisi MSREqPCR ad alto rendimento a 96 plessi saranno analizzati dalla bioinformatica e dalla biostatistica per condurre 1) confronto di classe tra il clinico pertinente sottotipi e classi per definire geni significativamente differenzialmente metilati; 2) analisi di previsione di classi multivariate utilizzando diversi approcci di selezione delle caratteristiche basati su valori p a marcatore singolo. Diversi algoritmi di classificazione (ad es. k-nearest neighbor, macchine vettoriali di supporto, analisi di discriminazione lineare ecc.), utilizzando la validazione incrociata 10 volte e/o la convalida incrociata leave-one-out per selezionare i migliori marcatori di metilazione candidati - e algoritmi; inoltre, i valori top-AUC dei singoli marcatori di metilazione candidati saranno definiti nell'analisi ROC e presi in considerazione per la selezione dei marcatori.

Un sottoinsieme di 48 marcatori candidati verrà selezionato per la conferma in un set di campioni separato. I dati di metilazione derivati ​​da ciò saranno analizzati utilizzando il confronto di classe e l'analisi di predizione di classe in modo simile al primo insieme di dati derivati ​​dall'analisi 480plexed. Saranno definiti i migliori marcatori singoli e combinazioni di marcatori dall'analisi multivariata. I risultati della classificazione ei dati di metilazione saranno confrontati con i risultati dei test di mutazione p53 per valutare il potenziale della classificazione diagnostica basata sulla metilazione, come unica e in combinazione con l'analisi della mutazione p53. Questo sarà condotto applicando diversi approcci di predizione di classe integrando sia i dati di p53 che quelli di metilazione in modelli multivariati.