Korkea-asteisen munasarjasyövän varhainen havaitseminen käyttämällä kohdunhuuhtelu-EHUD-tutkimusta ja kaksisuuntaista sekvensointia (EHUD)

LÄHESTYMISTAPA VAIHE I Washingtonin yliopisto on osoittanut periaatteellisen diagnostisen todisteen; Teollisen mittakaavan käyttöönottoa varten tarvitaan kuitenkin lisäoptimointia ja validointia. Vaiheessa I UtL-suodatusmenetelmä optimoidaan (tavoite 1), kaupallisen työnkulun analyyttinen suorituskyky validoidaan (tavoite 2) ja näytteenoton virstanpylväs saavutetaan (tavoite 3). Tavoite 1. Määritä kohdun huuhtelusuodatuksen käyttökelpoisuus kasvainperäisen DNA:n rikastumisen maksimoimiseksi. Alustava testaus kahdella näytteellä osoitti, että UtL-solujen suodatus endometriumin soluryhmien poistamiseksi voisi lisätä herkkyyttä kasvainmutaatioille useita kertoja. Tätä tietojoukkoa laajennetaan analysoimalla suodatusvaikutus 10 UtL:ssä potilailta, joilla on HGSC ja joilla on tunnettuja TP53-mutaatioita. Jokainen UtL jaetaan kahtia: ensimmäinen puolikas suodatetaan ja toinen jää suodattamattomaksi. DNA uutetaan suodatetuista, suodoksista ja suodattamattomista fraktioista ja analysoidaan TP53 DS:llä (yhteensä 30 näytettä). Jokaisen UtL:n osalta verrataan DNA-saantoa kussakin fraktiossa ja kasvainmutaation MAF:a. Odotetaan, että suodatettu fraktio sisältää vähemmän DNA:ta kuin suodattamaton fraktio, mutta kasvainmutaatiota esiintyy useammin. Jos herkkyys paranee (eli rikastamalla saadaan enemmän kuin häviää pelkistämällä vähemmän saatavilla olevasta DNA:sta), kaikissa tulevissa näytteissä käytetään suodatusta. Tavoite 2. Optimoidun määrityksen validointi: tarkkuus, tarkkuus, havaitsemisraja ja toistettavuus. TwinStrand on kehittänyt virtaviivaistetun DS-työnkulun käyttämällä parannettuja sovittimia, ligaatiokemiaa ja korkean suorituskyvyn 96-kuoppalevypohjaista formaattia, joka soveltuu nesteenkäsittelyroboteille ja on yhteensopiva CLIA-laboratoriostandardien kanssa.

TwinStrand on myös kehittänyt optimoidun pilvipohjaisen analyysiputken, joka tukee useiden näytteiden automaattista rinnakkaiskäsittelyä. Optimoitu prosessi TP53-mutaatioiden havaitsemiseksi UtL-näytteistä validoidaan. Tarkkuuden, teknisen tarkkuuden ja havaitsemisrajan arvioimiseksi DNA-näytteet kahdesta yksilöstä, jotka eroavat genotyypistä > 5 SNP-kohdassa TP53:ssa tai sen lähellä, sekoitetaan suhteissa 1:100 1:5 000, kaksi UtL. Seokset sekvensoidaan noin 10 000 x molekyylisyvyydellä kahdessa riippumattomassa kokeessa. SNP-alleelifraktiota (AF) verrataan eri laimennoksilla tarkkuuden (odotettu AF vs. havaittu AF), tarkkuuden (AF-vaihtelu replikaattien välillä) ja alimman saavutettavissa olevan havaitsemisrajan määrittämiseksi. Määrityksen toistettavuuden testaamiseksi sen aiotussa kliinisessä käytössä sekvensointi toistetaan 30 käytetyllä näytteellä Tavoite 1, joka kattaa laajan valikoiman kasvaimen MAF:eja. Sponsori laskee toistokertoimen. Pilottitutkimusten perusteella Sponsori odottaa erinomaista toistettavuutta (CV<5%). Tavoite 3. Näytteenotto. Vaiheessa II ehdotettujen näytteiden kerääminen aloitetaan kunkin osallistuvan laitoksen asianmukaisen IRB/eettisen komitean hyväksynnän jälkeen.

Keräyksen jälkeen näytteet lähetetään Wienin lääketieteellisen yliopiston syöväntutkimuksen instituuttiin, joka suorittaa UtL-suodatuksen ja DNA:n erottamisen.

Parillinen DNA myös Pap-kokeista ja perifeerisistä leukosyyteistä uutetaan. Eristetyille DNA:ille annetaan de-tunnistusnumero ja ne lähetetään TwinStrandille duplex-sekvensointia varten.

Vaiheen I virstanpylväät:

1. Vahvista UtL-suodatuksen hyödyllisyys kasvainmutaatioiden rikastamiseen.
2. Kvantifioi virtaviivaistetun määrityksen tarkkuus, tarkkuus, havaitsemisen alaraja ja toistettavuus UtL:issä.
3. Aloita näytteiden kerääminen vaihetta II varten.

Vaiheen I tuotteet:

1. DS-työnkulku on valmis käytettäväksi UtL DNA:ssa kaupallisessa mittakaavassa vaiheissa II ja vaiheissa III.
2. Näytepankki vaiheeseen II

LÄHESTYMINEN VAIHE II Vaihe II validoi TP53 DS:n käytön UtL:issä munasarjasyövän varhaiseen havaitsemiseen laajennetun tapauskontrollin potilasryhmissä, jotka kattavat sekä keskimääräiset että korkean riskin populaatiot. Ennalta määritetyt parametrit, jotka voivat vaikuttaa TP53-mutaatiotaajuuden herkkyyteen ja spesifisyyteen, tutkitaan ja mallinnetaan tilastollisesti. Kliininen herkkyys ja spesifisyys maksimoidaan rakentamalla yksilöllisiä diagnostisia kynnystilastomalleja käyttämällä monimuuttujia kliinisiä ominaisuuksia sekä jokaisen yksilön ainutlaatuista taustamutaatiokuormaa, joka perustuu leukosyyttisekvensointiin. Potilaiden osaryhmässä vahvistetaan UtL-testin ylivoimainen suorituskyky Pap-näytteenottoon verrattuna. Lisäksi proof of concept -tutkimus suoritetaan mukana olevien potilaiden alajoukossa 96 HGSC:n kannalta merkityksellisen metylaatiomarkkerin tutkimiseksi UtL:issä ja vastaavissa kasvainkudoksissa/STIC:issä.

TAVOITE 1. YLEISEN VÄESTÖN MUNASARJOSyövän SEULONTA Tavoitteena on kehittää biomarkkeri HGSC:n havaitsemiseen keskimääräisessä riskipopulaatiossa. Sponsori suorittaa tapauskontrollitutkimuksen, joka yhdistää TP53 DS:n mutaatiotiedot klinikan patologisiin tietoihin, jotta voidaan tunnistaa naiset, joilla on HGSC mahdollisimman herkkä ja spesifinen. Yli 98 % HGSC:istä kantaa mutaatioita TP53:ssa, mikä tarkoittaa, että erittäin syvä DS voidaan keskittyä kustannustehokkaasti vain pienelle genomialueelle. Tämän tavoitteen tuote on 200 potilaan biomarkkeritietosarja, joka osoittaa tämän kriittisen tarpeellisen munasarjasyövän diagnostiikan kustannustehokkaan, kaupallisesti vankan suorituskyvyn.

Tavoite 1A: Arvioida TP53 DS:n testin suorituskykyä UtL:illä HGSC:n havaitsemiseksi keskimääräisen riskin potilailla.

Menetelmät: UtL-näytteet 200 koehenkilöstä keskimääräisestä riskipopulaatiosta analysoidaan DS:n kautta: 100 koehenkilöä, joilla oli HGSC (tapaukset) ja 100 koehenkilöä, joilla on leesiot, jotka lopulta todettiin hyvänlaatuisiksi resektion jälkeen, eli ilman syöpää (kontrollit). Kaikilta potilailta UtL kerätään ennen leikkausta munasarjamassaa varten. Huuhtelu suoritetaan kuukautiskierron luteaalivaiheessa, jos se on ennen vaihdevuosia. Kirurgiset näytteet arvioidaan patologisesti ja potilas lasketaan HGSC-positiiviseksi tai kontrolliksi histologisista tuloksista riippuen. Syöpäpotilailla Wienin lääketieteellinen yliopisto sekvensoi primaarisen kasvaimen tavanomaisin menetelmin geenipaneelille, joka sisältää TP53:n, BRCA1:n ja BRCA2:n. Kaikista identifioimattomista potilasnäytteistä kerätyt kliiniset tiedot sisältävät seuraavat: ikä, tupakointihistoria, aikaisempi kemoterapiaaltistus, pariteetti, vaihdevuosien ikä, kuukautisten alkamisikä, oraalisten ehkäisyvalmisteiden käyttöhistoria, syövän sukuhistoria ja seitsemän primaarisen kasvaimen geenimutaatiostatus. Tapaukset ja kontrollit ikääntyvät ja mukaan otetaan mahdollisimman laaja ikähaarukka, jotta voidaan arvioida iän vaikutusta herkkyyteen ja spesifisyyteen.

Tilastollinen analyysi: Yksityiskohtainen mutaatioprofiili kullekin näytteelle luodaan duplex-sekvensoinnin tulostiedostoista, mukaan lukien: mutanttialleelitaajuus (MAF) kaikille mutatoituneille asemille, mutaatiospektri, ennustettu patogeenisyys proteiinin toimintaan, suhde tunnettuihin hotspoteihin ja yleinen mutaatiokuormitus (mutanttien nukleotidien lukumäärä jaettuna sekvensoitujen nukleotidien kokonaismäärällä). Tämän jälkeen näytteistä avataan tapausten ja kontrollien tila. UtL:n keräämästä DNA:sta saatua TP53 MAF:a käytetään ennustajana erotettaessa keskimääräisen riskin potilaita (AIM I), joilla on ja ei ole HGSC:tä logistisella regressiomallinnuksella. Ikä, tupakointihistoria, aikaisempi altistuminen kemoterapialle, pariteetti, vaihdevuosien ikä, kuukautisten alkamisikä, oraalisten ehkäisyvalmisteiden käyttöhistoria, syövän sukuhistoria ja ituradan mutaatioiden tila katsotaan mahdollisiksi sekaannuksiksi. Mallin ennuste arvioidaan ristiinvalidoinnin avulla. Analogista analyysiä sovelletaan suuren riskin potilaiden ryhmään (AIM II), jossa STIC:n esiintyminen ja puuttuminen määrittää tulosmuuttujan. Molemmissa tapauksissa ehdotetaan mutanttialleelifrekvenssin raja-arvoja, ja spesifisyys ja herkkyys arvioidaan, mukaan lukien asianmukaiset luottamusvälit.

Tavoite 1B: Diagnostisen suorituskyvyn parantaminen personoidulla kalibroinnilla taustamutaatiokuormituksen avulla.

DS:n ennennäkemätön herkkyys johti meidät sitten muut uuteen havaintoon, että syövän kaltaiset mutaatiot kerääntyvät hyvin alhaisilla tasoilla iän myötä useisiin ihmiskudoksiin. Pilottitutkimuksessa sponsori havaitsi, että keskimääräinen BB-mutaatiokuormitus on jonkin verran suurempi UtL:issä kuin muissa kudoksissa, mahdollisesti johtuen kohdun limakalvokudoksesta peräisin olevan DNA:n vaikutuksesta, joka replikoituu laajasti ennen vaihdevuosia. Vaikka tämä ei vaarantanut pilottitutkimuksen spesifisyyttä, sponsori myönsi, että BB voi muodostaa esteen joissakin hyvin varhaisissa kasvaimissa, joissa MAF-signaali on alhainen, tai erittäin iäkkäille naisille, joilla tausta on korkea. Sponsori odottaa, että huuhtelusuodatus ja luteaalivaiheen kerääminen premenopausaalisilla naisilla vähentävät BB-signaalia, mutta lisätoimenpiteenä sponsori tutkii, voidaanko suorituskykyä edelleen parantaa normalisoimalla yksilön taustamutaatiokuormitus. Sponsori olettaa, että TP53-mutaatioiden taso kiertävissä leukosyyteissä voi toimia empiirisesti mitattuna henkilökohtaisena kalibraattorina, joka tallentaa paitsi tunnettuja BB:tä lisääviä tekijöitä, kuten ikää, myös tuntemattomia mutageenisia altistuksia tai muita ihmisen elämän aikana tapahtuvia tekijöitä. Vaikka leukosyyteistä peräisin oleva DNA vaikuttaa luultavasti vain minimaalisen määrän BB-mutaatioiden kokonaismäärään UtL:issä, sponsori väittää, että ne voivat toimia sananmukaisena "kanaarina hiilikaivoksessa", joka edustaa suhteellisesti BB-mutaatioita muualla kehossa. Itse huuhtelun BB-mutaatiokuormaa ei voida mitata suoraan todellisessa ympäristössä, kun kasvaimen aiheuttamaa mutaatiota ei tunneta. Tämän käsitteen uskottavuus osoitti alkuperäinen tutkimuksemme TP53-mutaatioista peritoneaalisessa nesteessä, joka sisälsi joukon vastaavia verinäytteitä ja osoitti vahvan yhteyden BB:n ja iän välillä.

Menetelmät: DNA perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) komponentista - kerätty välittömästi ennen leikkausta - satunnaisesti valitusta 50:stä 100 HGSC-tapauksesta ja 50:stä 100:sta kontrollista tavoitteesta 1A uutetaan ja altistetaan TP53 DS:lle ~10 000-kertaisella molekyylitasolla. syvyys. PBMC-solujen TP53-mutaatiot vähennetään UtL:stä löydetyistä TP53-mutaatioista.

Tilastollinen analyysi: Sponsori tutkii UtL:n TP53-mutaatiotaajuuksien ja leukosyyttien välisen yhteyden ja määrittää, vastaavatko väärät negatiiviset tulokset tavoitteessa 1A tapauksia, joissa leukosyyttien BB on lisääntynyt. Lisäksi toimeksiantaja analysoi TP53-mutaatioiden esiintymistiheydet leukosyyteissä tapauksen kontrollitilan ennustajana käyttäen jälleen 10 %:n jättämistä pois -menettelyä. Tätä innovatiivista kalibrointimenetelmää verrataan yksinkertaisiin ROC-mittareihin, jotka saavutetaan yksimuuttujamallilla, jossa käytetään kiinteää mutaatiofraktiota, sekä muokattuun monimuuttujamalliin, joka on kehitetty potilaan muiden ominaisuuksien, kuten iän, perusteella. Tieteellisenä kysymyksenä, joka ei liity nykyisiin tavoitteisiin, sponsorit haluavat innokkaasti nähdä, toimiiko leukosyyttien TP53-mutaatiokuorma potilaan iän, yleisen terveydentilan tai mutageenisten altistumisen historian riippumattomana ennustajana.

Tavoite 1C. Kohdunhuuhtelun diagnostisen suorituskyvyn vertaaminen vs. Pap-kokeesta kerätty DNA.

Ensimmäinen raportti NGS:n käyttämisestä munasarjasyövän havaitsemiseen trans-emättimen nestebiopsiasta perustui Pap-kokeen keräämiseen ja SafeSeqS:ään sekvensointiteknologiana. Mainittu 41 %:n herkkyys oli tärkeä todiste periaatteesta, mutta myös runsaasti parantamisen varaa. Sponsori on lopullisesti osoittanut DS:n ylivertaisen tarkkuuden SafeSeqS:n kaltaisiin menetelmiin verrattuna, ja laboratoriossamme meneillään olevat tutkimukset osoittavat, että Papa-kokeiden herkkyys on rajoitettua UtL:ään verrattuna. Kahden keräysmenetelmän suora vertailu samoilla potilailla on kuitenkin vielä suorittamatta. UtL:n paremmuuden muodollinen osoittaminen Pap-testeihin verrattuna auttaa pääsemään kaupallisille markkinoille (sponsori huomauttaa, että asiaan liittyvä NCI SBIR on myönnetty PapGene Inc:lle, edellä mainitun tutkimuksen tekijöiden perustamalle yritykselle). UtL:n paremmuuden odotetaan perustuvan siihen, että huuhteluvedet saavuttavat munanjohtimien ja munasarjojen pintojen, kun taas Pap-näytteet perustuvat kohdunkaulan kanavaan pääseviin disseminoituneisiin syöpäsoluihin. Kuitenkin siinä tapauksessa, että TP53 DS Pap-kokeissa ei ole merkittävästi huonompi kuin UtL, sponsori tutkii edelleen tätä täydentävää keräysmenetelmää. Koska perusterveydenhuollon tarjoajat tekevät rutiininomaisesti papa-kokeita, niiden käyttö voi nopeuttaa niiden käyttöönottoa markkinoilla. Nykyiset todisteet viittaavat kuitenkin Papa-kokeiden todennäköiseen huonompaan asemaan.

Menetelmät: Sponsori suorittaa TP53 DS:n kuten edellä, mutta käyttämällä DNA:ta Pap-näytteistä, jotka on kerätty ennen leikkausta satunnaisesti valitusta, ikävastaavasta alajoukosta, jossa on 25 syöpätapausta ja 25 kontrollia tavoitteesta 1A.

Tilastollinen analyysi: Tietoja TP53 MAF:sta DNA:sta, joka on kerätty tavanomaisilla papa-kokeilutesteillä keskimääräisen riskin potilaiden osanäytteestä, pidetään lisäennustajana malleissa, jotka on kehitetty tavoitteiden 1A ja 1B puitteissa. Toimeksiantaja tutkii, onko lisävaltuuksia erottaa tapaukset kontrolleista. voidaan saada yhdistämällä tiedot Pap-kokeista ja UtL:istä.

TAVOITE 2. KORKEAN RISKIN VÄESTÖN MUNASARJOSyövän SEULONTA Tämä tavoite noudattaa samanlaista lähestymistapaa kuin tavoite 1, mutta keskittyy naisiin, joilla on suuri riski saada munasarjasyöpä perinnöllisistä rinta- ja munasarjasyövistä (HBOC) johtuvista mutaatioista. HBOC-naiset on tunnistettu vahvan suvussa rinta- tai munasarjasyöpää sairastavien geenien perusteella, ja niiden on todettu kantavan mutaatioita syöpäalttiusgeeneissä, yleensä BRCA1- ja BRCA2-geeneissä, jotka antavat 35 %:n, 46 %:n ja 13 %:n, 23 %:n HGSC-riskin koko elinikäisenä. vastaavasti. Hoitostandardi on salpingooophorectomy (RRSO) -riskin vähentäminen varhaisessa iässä, tyypillisesti synnytyksen päätyttyä. Vaikka tämä lähestymistapa vähentää kuolleisuutta, se on epätäydellinen: noin 10 prosenttia tämän väestön munasarjasyövistä kehittyy ennen 40 vuoden ikää. Wienin tapaussarjassa syöpiä on havaittu jo 20-vuotiaana, mikä on paljon ennen kuin ennaltaehkäisevä leikkaus olisi normaalisti tehty. Siten jopa tavanomaisella hoidolla HBOC-naisilla lisääntymisvuosina on huomattavasti suurempi riski sairastua munasarjasyöpään verrattuna muihin naisiin, heidän tehokkaan seulontatyökalunsa tarve on vielä suurempi. Tällä hetkellä sairastuneiden naisten on tehtävä päätös joko hyväksyä lisääntynyt riski sairastua erittäin tappavaan syöpään tai päättää unohtaa (tai keskeyttää) synnytyksen. Tämä on tuskallisen haastava päätös, jonka kohtaavat sadat tuhannet naiset pelkästään Yhdysvalloissa. Tietyissä etnisissä ryhmissä, erityisesti ashkenazi-juutalaisissa, riski olla kantaja on jopa 1:40. Silti suurin osa BRCA-kantajista, jopa niille, joille ei ole tehty leikkausta, ei koskaan kehitä HGSC:tä. Naisten, joilla on suuri HGCS-riski, tarvitaan kiireellisesti varhaisen havaitsemisen diagnostisia työkaluja ihmishenkien pelastamiseksi ja hedelmällisyyden valinnan säilyttämiseksi. Tämän tavoitteen tuote on 115 potilaan biomarkkeritietosarja, joka osoittaa tällaisen määrityksen kaupallisesti vankan suorituskyvyn.

Tavoite 2A. Arvioida TP53 DS:n testin suorituskykyä UtL:illä HGSC:n havaitsemiseksi suuren riskin potilailla.

Sponsori lähestyy tätä tutkimusta tavoitteen 1A yleisten menetelmien mukaisesti. Yksi merkittävä ero on se, että UtL kerätään HBOC-naisista, joille tehdään RRSO, eikä naisilta, joiden munasarjamassat ovat tiedossa. RRSO:n jälkeen munasarjat ja munanjohtimet läpikäyvät huolellisen leikkausprotokollan, joka tunnetaan nimellä SEE-FIM, jotta kudokset, erityisesti fimbriat, tutkitaan huolellisesti STIC-syöpien ja okkulttisten syöpien varalta. Tästä suuren riskin väestöstä tällaisia ​​vaurioita löytyy noin 5 prosentissa resektioista. Syöpäryhmään kuuluvat naiset, joilta SEE-FIM:n aikana löydettiin STIC:itä tai okkulttisia kasvaimia, kontrolliryhmään kuuluvat naiset, joilla ei ole leesioita. Tämä tutkimussuunnitelma on innovatiivinen siinä mielessä, että se ei keskity pelkästään suuren riskin naisiin, vaan erityisesti analyysimme kykyyn havaita hyvin varhaisessa vaiheessa olevia, mahdollisesti jopa mikroskooppisia syöpiä, kun ne pysyvät kirurgisesti parannettavissa.

Menetelmät: UtL-näytteet jopa 115 naiselta, joilla on perinnöllinen korkean riskin munasarjasyöpäoireyhtymä, analysoidaan DS:n kautta: 15 STIC-syövän tai piilevän syövän kanssa (tapaukset) ja 100 syöpävapaata (kontrollit). Kotelo ja valvonta sovitetaan iän mukaan. UtL:t suoritetaan välittömästi ennen RRSO:ta. Kirurgiset näytteet arvioidaan patologisesti keskitetysti standardoidulla SEE-FIM-protokollalla. RRSO:n jälkeen munasarjat ja munanjohtimet läpikäyvät huolellisen leikkausprotokollan, joka tunnetaan nimellä SEE-FIM, jotta kudokset, erityisesti fimbriat, tutkitaan huolellisesti STIC-syöpien ja okkulttisten syöpien varalta. Sponsori odottaa tunnistaneensa 5–15 naista, joilla on STIC- tai piilevä syöpä, tästä kohortista, ja 100 vastaavalla naisella ei ole havaittuja leesioita. Syöpätapausten pienempi määrä kuin verrokkeja heijastaa leesiopositiivisten leikkausten pientä prosenttiosuutta ja näytteen määrää, jonka sponsoriprojekti realistisesti pystyy saavuttamaan. Vaikka suurempi määrä olisi optimaalinen, tällaisia ​​näytteitä on erittäin vähän. Syöpäryhmään kuuluvat naiset, joilta STIC:t tai okkulttinen HGSC löydettiin SEE-FIM:n aikana, kontrolliryhmään kuuluvat naiset, joilla ei ole leesioita. Tilastoanalyysi: Tämä on tavoitteen 1A mukainen.

Tavoite 2B. Diagnostinen kynnyskalibrointi korkean riskin naisilla taustamutaatiokuorman perusteella.

Tämä alatavoite käyttää samaa protokollaa ja tilastollisia menetelmiä tavoitteessa 1B ja soveltaa niitä tavoitteen 2 korkean r isk populaation osalta.

Menetelmät: Leukosyytti-DNA kaikista saatavilla olevista syöpätapauksista ja satunnaisesti valitusta kontrolliryhmän 30 naisen alajoukosta arvioidaan. On vakiintunutta, että pahanlaatuisten kasvainten riski HBOC-naisilla on kohonnut muihin verrattuna DNA-korjausvirheiden vuoksi, jotka lisäävät onkogeenisten mutaatioiden syntymisen todennäköisyyttä. Sellaisenaan sponsori olettaa, että ei-syöpäperäinen taustamutaatiokuorma, joka mitataan UtL:issä sekä ääreisveressä, voi olla myös suhteellisesti kohonnut. Sopeutuminen verestä mitattuun korkeaan taustamutaatiokuormaan voi olla erityisen tärkeää spesifisyyden lisäämiseksi tässä ryhmässä.

Tilastollinen analyysi: Tämä on tavoitteen 1B mukainen.

AIM III Määrittää metylaatioallekirjoitus HGSC-tunnistukseen UtL:issä. DNA-metylaatioanalyysin merkitys epigeneettisten, kasvainspesifisten muutosten havaitsemisessa on osoitettu viimeisen 15 vuoden aikana erityisesti syöpädiagnostiikassa. DNA-metylaatiotutkimukset munasarjasyövässä (OC) keskittyivät OC-solujen verenkiertoon erittämien DNA-fragmenttien havaitsemiseen (esim. soluvapaa DNA - cfDNA) viittaavat siihen, että cfDNA:n DNA-metylaatiomallit voivat havaita osuuden OC:ista jopa kaksi vuotta ennen diagnoosia. Tämä tutkimus osoittaa myös selvästi tämän lähestymistavan rajoituksen, koska vain 50 % kaikista potilaista, joille lopulta kehittyi korkea-asteinen seroosinen munasarjasyöpä (HGSC) kahden vuoden kuluessa, pystyttiin havaitsemaan. Taustalla oleva ongelma on, että verenkierron alhaisen cfDNA-pitoisuuden vuoksi on havaittava erittäin heikko signaali. Tavoitteena mahdollisesti lisätä HGSC:n havaitsemisen herkkyyttä sponsori suorittaa yhteistyössä professori Andreas Weinhäuselin kanssa Itävallan teknillisen instituutin (AIT) kanssa Competence Unit Molecular Diagnostics -yksikön pätevyysyksiköstä proof of concept -tutkimuksen potilaiden alajoukolle, jotka sisältyvät Tämä projekti. Professori Andreas Weinhäusel tunnisti 96 HGSC:lle relevanttia metylaatiomarkkeria. Vain hyvin pieni määrä DNA:ta tarvitaan DNA:n metylaatioon. Siksi on suositeltavaa käyttää jo saatavilla olevaa huuhteluvesien DNA:ta ja vastaavaa kasvainkudosta, joka on uutettu tämän tutkimuksen aikana, testausmenettelyn spesifisyyden ja herkkyyden edelleen kehittämiseen. AIM3:n tuote on 140 potilaan metylaatiomarkkerin tietojoukko, joka osoittaa tällaisen määrityksen erittäin herkän suorituskyvyn.

Menetelmät: UtL:n genominen DNA ja vastaava kasvainkudos 30 HGSC-potilaalta ja 10 STIC:ltä/okkulttisesta syövästä rikastetaan metyloituneen DNA:n suhteen metylaatioherkkien restriktioentsyymien avulla. Tämä DNA analysoidaan suorittamalla highthrough put-qPCR, jossa 5 x 96 markkeri x 96 DNA analysoidaan rinnakkain. Informatiivisimmat merkit yhdistetään metylaatioallekirjoitukseksi. Allekirjoitus-DNA:n spesifisyyden osoittamiseksi UtL:istä analysoidaan 60 kontrollista (30 keskimääräistä riskiä ja 30 korkean riskin tapausta). DNA-metylaatiokuvion arviointi suoritetaan resektiota edeltävillä huuhteluilla ja enintään 10 STIC-leesiolla/okkulttisella syövällä. Kun paikalliset patologiset tulokset tunnistavat STIC-soluja tai piileviä syöpäsoluja (FFPE-kudosta), suoritetaan lasermikrodissektio ja DNA-eristys. Myöhemmin standardin NGS TP53 -sekvensoinnin soveltaminen suoritetaan AIM 1:ssä ja AIM 2:ssa kuvatulla tavalla. Tässä pilottialatutkimuksessa jäljelle jäävään DNA-materiaaliin sovelletaan high-through put-qPCR:ää metylaatiotilan arvioimiseksi.

Tilastollinen analyysi: Pyrkimyksenä on arvioida mahdollisuuksia määrittää DNA-metylaatioallekirjoitus yksinkertaista PCR-testausta varten, bioinformatiikka ja biostatistiikka analysoivat dCT-PCR-arvot 96-plexed high-throughput MSREqPCR-analyysistä, jotta voidaan suorittaa 1) luokkavertailu asiaankuuluvien kliinisten tutkimusten välillä. alatyypit ja luokat merkittävästi erilailla metyloituneiden geenien määrittämiseksi; 2) monimuuttujaluokan ennusteanalyysi käyttäen erilaisia ​​piirteiden valintamenetelmiä, jotka perustuvat yhden markkerin p-arvoihin. Erilaiset luokitusalgoritmit (esim. k-lähin naapuri, tukivektorikoneet, lineaariset erotteluanalyysit jne.) käytetään käyttämällä 10-kertaista ristiinvalidaatiota ja/tai jätä yhden pois ristiinvalidointia parhaiden ehdokkaiden metylaatiomarkkerien - ja algoritmien valinnassa; lisäksi yksittäisten metylaatiomarkkerien huippu-AUC-arvot määritellään ROC-analyysissä ja otetaan huomioon markkerien valinnassa.

48 ehdokasmarkkerin osajoukko valitaan vahvistettavaksi erillisessä näytesarjassa. Niistä johdetut metylaatiotiedot analysoidaan käyttämällä luokkavertailua ja luokkaennusteanalyysiä samalla tavalla kuin ensimmäinen datajoukko, joka on johdettu 480-plexed-analyysistä. Parhaiten menestyvät yksittäiset markkerit ja markkerien yhdistelmät monimuuttujaanalyysistä määritellään. Luokittelutuloksia ja metylaatiotietoja verrataan p53-mutaatiotestin tuloksiin metylaatioon perustuvan diagnostisen luokituksen potentiaalin arvioimiseksi, ainoana ja yhdessä p53-mutaatioanalyysin kanssa. Tämä tehdään käyttämällä erilaisia ​​luokkaennustusmenetelmiä integroimalla sekä p53- että metylaatiodataa monimuuttujamalleissa.