慢性腰痛におけるエキソソームが豊富な多血小板血漿（PRP）の椎間板内注射

慢性腰痛 (LBP) の管理は、その高い社会経済性に貢献しています。椎間板は、慢性腰痛の 40% 以上の症例を占めています。 利用可能な治療オプションは、その症状を解決しますが、根底にある変性状態を改善しません. これは、椎間板に起因する痛みの根本的な原因を実際に治療する新しい治療法および/または介入の必要性を示しています。 線維輪と髄核への PRP の直接注入による生物学的療法は、効果的で実現可能な選択肢のようです。

血液由来のエキソソームは、幹細胞の固有の特性の一部を他の幹細胞に伝達する可能性があり、幹細胞性の維持、分化、自己再生、および修復を促進します。

LBP におけるエキソソームの安全性と有効性を比較するために、制御された無作為化二重盲検臨床試験を実施することを提案します。 インフォームド コンセントは、研究参加前にすべての被験者から得られます。

PRP の準備:

血液サンプル (60 ml) を 600 xg で 10 分間遠心分離して、血漿画分を収集します。 4000×gで15分間遠心分離した。 次いで、上澄みの乏血小板血漿（ＰＰＰ）を除去し、１ｍｌのＰＲＰを残す。 PPP は、PPP 画分に存在するすべての血小板がフィルターにトラップされるように、1 ミクロンの特別な独自設計のフラッシュ バック フィルター (Alpha Corpuscle、デリー、インド) を通過します。 これらのトラップされた血小板は、ほとんどの血小板を回収するために 1 ml の PPP で洗い流されます。 これを一緒に混合し、WBC フィルター (テルモ イムガード、米国) に通して白血球をろ過します。 最終的な PRP 濃縮液 (0.1 ml) は、総白血球数と血小板数について分析されます。 10％塩化カルシウムで再構成されたウシトロンビンで処理された5つのサンプルが無作為に選択され、ELISAによって成長因子[血小板由来成長因子（PDGF）および血管内皮成長因子（VEGF）]について評価されます。

平均して、私たちの PRP サンプルには、最終 PRP 2ml 中に 1000 億個の血小板と 30 倍濃縮された血小板が含まれます。

エクソソームの準備:

EDTA でコーティングされたチューブ内の 60 ml の血液を 4 °C で 1,200 g で 10 分間回転させて、血漿を分離します。 血漿は（0.22μm）フィルターでろ過されます。 血漿を移している間、ペレット状の材料は避けてください。 ペレット化した材料を廃棄します。 このチューブには、エクソソームやその他の成長促進タンパク質を濃縮するための特別なフィルターが付いています。 チューブを 3000 g、RT、30 分で遠心分離し、エキソソームを収集してから濃縮します (0.5 ml から 3 ml)。 フィルターの壁に詰まったエクソソームを回収するには、20 ml の NS (できれば PBS) をマイクロ遠心チューブに加え、3,500 g で遠心分離します。 フィルターの壁に詰まったエクソソームの濃縮スープを再度回収します。

タンパク質含有量の定量化は、ビシンコニン酸 (BCA) アッセイによって行われます。

ナノ粒子追跡分析 (NTA) 1×107/ml から 1×109/ml の濃度のベシクル懸濁液を、405 nm レーザーを搭載した Nanosight NS300 (NanoSight Ltd.、英国) を使用して検査し、粒子のサイズと量を決定します。分離されました。 60 秒間のビデオが 30 フレーム/秒のフレーム レートで撮影され、NTA ソフトウェア (バージョン 2.3; NanoSight Ltd.) を使用して粒子の動きが分析されます。

ウエスタンブロット分析 エキソソームの上清をサンプルバッファーで変性させ、ウエスタンブロット分析にかけます。 精製されたエキソソームは、HSP70、フロチリン、CD63、TSG101、およびカルネキシンのタンパク質発現について分析されます。 タンパク質は、Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager システム (Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州バークレー) で可視化されました。

研究デザイン 患者は、髄核の中心にエキソソームを含む PRP または同量のプラセボを受ける 2 つのアームに無作為に割り付けられ、2 人の介入脊椎および内科医によって評価されます。

無作為化と研究のアーム:

約 300 人の患者をスクリーニングして、治療群または対照群に 1:1 の比率で無作為に割り当て、30 人の患者を各 4 つのアームに割り当てます。

1. アーム I はプラセボを受け取るように割り当てられます (C アームの下のトリガー ポイント注射)

2. アーム II: 髄核の中心にエクソソームを含む PRP を投与する (2ml) 試験製品、投与量および投与方法 治療期間 コンピュータで生成された数に基づいて患者を無作為に選択し、見分けがつかない PRP を 1 回注射します。またはプラセボ。 背部の皮膚消毒に続いて、調達された総ＰＲＰｅｘから２ｍｌが、Ｘ線透視誘導側方アプローチによってできるだけ早く注射された。 患者は同様の方法でプラセボを受け取りましたが、ディスクには入れませんでした。 トリガーポイントの周りの筋肉ゾーンになります.研究を評価した医師と患者は治療について知られていませんでした. 患者は、通常の運動、定期的な予防措置、理学療法、背中のケアを続けるようにアドバイスされました。

   パラセタモール (最大 1 グラムまで) を 1 日 3 回、レスキュー ドラッグとして使用することが許可されます。 全身性コルチコステロイド、症状を修正する可能性のある薬物/手順は、研究中に許可されません。

   研究評価/アウトカム指標

   1. ビジュアル アナログ スケール (VAS)
   2. ローランド モリス障害アンケート (RDQ)
   3. SF 36 健康アンケート
   4. 機能評価指数

   5. MRI - 椎間板変性等級付け、T2定量化 椎間板炎のあらゆる証拠 患者は、ビジュアルアナログスケール（VAS）、SF 36健康アンケート、ベースラインでの機能評価指数によって評価され、1、3、6、および12か月で追跡されます。 構造的有効性は、2 人の経験豊富な放射線科医によるベースライン時および 6 か月時の文献で前述したように、MRI t2 定量化およびグレーディングによって評価されます。 評価者は盲目になります。

      モニタリング訪問は、標準的なモニタリング手順に従って実施されます。

      特定の理由による治療の中止が確認されます。 感染症/椎間板炎の証拠は注意深く観察されます。 痛みの悪化は深く分析されます。

      患者は、最初の 1 か月間は週に 1 回、その後 6 か月までは月に 1 回、副作用とバイタル サインについて評価されます。 研究への参加時、6 か月時、および生物学的変数ならびに肝臓および腎臓の機能を調べるための最終来院時に、血液サンプルを採取しました。 忍容性が評価され、実験室ベースの血液学的および生化学的アッセイが実施されました。 治療群との因果関係の可能性も評価されます。

      統計分析：

      分散分析 (ANOVA) を使用して、グループ間の違いを調査します。 対応のあるサンプルの違いは、両側スチューデントの t 検定を使用して比較されます。 変数間の相関は、ピアソンの相関によって評価されます。 SPSS 20.0 は、統計分析に使用されます (SPSS, Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国)。 P < 0.05 は、統計的に有意であると見なされます。

      評価尺度による測定を使用して、安全性の問題/副作用と覚醒レベルとの関係を特定します。 安全性の問題/副作用と覚醒レベルの関係が IBRF ACP/MCP と標準治療グループの間で異なるかどうかをテストするために、評価尺度による測定を使用して、2 つの分析が行われます。 正準相関を使用して、どの副作用 (または副作用の組み合わせ) が評価尺度測定値の分散を説明するかを判断します。 さらに、クラスター分析を使用して、副作用が3つの治療グループの患者の覚醒レベルと結果に同様に関連しているかどうかを判断します.

      モニタリング手順/有害事象/安全性エンドポイント モニタリング モニターは、頻繁な電話および書面によるコミュニケーションを維持することに加えて、研究中にセンターを訪問します。

      以下のガイドラインは、21 CFR §812.46 で指定された要件を満たし、臨床研究を監視するための手順を説明するために提供されています。 治験責任医師が、署名された治験責任医師契約、プロトコル、または研究の条件 (不完全なデータフォームなど) を順守していない場合、モニターは治験責任医師の研究への参加を終了する権利を有します。

      研究前のモニタリング手順

      指定（つまり モニター）は、各治験責任医師が臨床試験を実施する際に生じる責任と義務を明確に理解し、受け入れることを決定し、文書化する責任があります。 モニターは、治験開始前に治験責任医師が次のことを確認します。

      • 十分に管理された研究の要件を理解する。

      • 臨床プロトコルの性質を理解する

      • 報告義務を理解する。

      • デバイス アカウンタビリティの要件を理解します。

      • 21 CFR パート 50 および 56 に従ってインフォームド コンセントを取得する義務を理解し、受け入れる。

      • 臨床調査を開始する前に IRB の審査と承認を取得し、21 CFR Part 56 に従って IRB による継続的な審査を確実に行う義務、および治験依頼者に関連するすべての IRB の行動を常に通知する義務を理解し、受け入れる。研究;

      • 臨床調査の財務開示に関する要件、21 CFR Part 54 を理解し、受け入れます。
      • 十分な設備があり、調査を実施するのに十分な数の適切な被験者にアクセスできる;
      • IRB の承認や署名済みの調査員契約など、必要な書類がファイルにある。

      定期的なモニタリング訪問 • モニタリング訪問は、臨床調査のモニタリングに関する FDA ガイドライン - 1988 年 1 月に従って実施されます。

      • モニターは定期的に各サイトを訪れ、次のことを確認する必要があります。

      • 設備は引き続き十分であり、許容範囲です。

      • プロトコルが適切に守られている。

      • IRB/IEC がプロトコルの変更を承認したか、通知を受けている。

      • 正確、完全かつ最新の記録が維持され、情報が記録されている。

      • 正確、完全、タイムリーな有害事象報告が提出されている

      • インフォームド コンセントが得られている。

      • 被験者が研究を中止した理由が文書化されている。

      • レポートは IRB とスポンサーに提出されています。

      • 適切なスタッフが研究活動を行っている。

      • 調査に関連するすべての症例報告フォームおよびその他の文書は、受領時に確認され、不備があれば速やかにサイトに通知されます。

      モニタリング訪問の頻度 a) モニタリング訪問は、標準的なモニタリング手順に従って実施されます。 モニタリング訪問は、以下を含むいくつかの要因に基づいて決定されます。 c) 以前の訪問からの未解決の問題の数。 d) 登録された科目の数; e) 調査員/サイトの数; f) 研究の複雑さ。

      研究の終了 すべての定期的な監視機能は、研究終了の訪問前に実行する必要があります。 研究終了の訪問は、モニタリング訪問と組み合わせることができます。 次のタスクは、モニターによる最後の訪問時に完了する必要があります。

   1. 調査員に記録を保持する義務があることを思い出させてください。 b) IEC の最終モニタリング報告書を作成する。

   モニタリング訪問報告

   すべての訪問について、監視レポートを作成する必要があります。 レポートには次の情報を含める必要があります。

   a) 訪問日b) 出席している研究施設職員のリスト。 c) 調査結果、問題点の要約