Injection intra-discale de Plasma Riche en Plaquettes (PRP) Enrichi en Exosomes dans la Lombalgie Chronique

La prise en charge de la lombalgie chronique (LBP) a contribué à son niveau socio-économique élevé. Le disque intervertébral représente 40 % ou plus des cas de lombalgie chronique. Les options de traitement disponibles n'améliorent pas la condition dégénérative sous-jacente, bien qu'elles résolvent ses symptômes. Cela indique le besoin de nouvelles thérapies et/ou interventions qui traitent réellement les causes sous-jacentes de la douleur discogène. Les thérapies biologiques par injection directe de PRP dans l'annulus fibrosus et le nucleus pulposus semblent une option efficace et faisable.

Les exosomes dérivés du sang peuvent potentiellement transmettre certaines des propriétés uniques des cellules souches à d'autres cellules souches, facilitant le maintien, la différenciation, l'auto-renouvellement et la réparation de la souche.

Nous proposons d'avoir un essai clinique contrôlé, randomisé, en double aveugle pour comparer l'innocuité et l'efficacité des exosomes dans la lombalgie. Le consentement éclairé sera obtenu de tous les sujets avant la participation à l'étude.

Préparation PRP :

L'échantillon de sang (60 ml) sera centrifugé à 600 × g pendant 10 min pour recueillir la fraction plasmatique. Et centrifugé à 4000xg pendant 15 min. Le plasma pauvre en plaquettes (PPP) surnageant sera ensuite éliminé, laissant 1 ml de PRP. Le PPP passera à travers un filtre de rinçage spécial d'un micron conçu localement (Alpha Corpuscle, Delhi, Inde) afin que toutes les plaquettes présentes dans la fraction PPP soient piégées dans le filtre. Ces plaquettes piégées seront rincées avec 1 ml de PPP pour récupérer la plupart des plaquettes. Cela sera mélangé puis passé à travers un filtre WBC (Terumo Imuguard, USA) pour filtrer les leucocytes. Le concentré final de PRP (0,1 ml) sera analysé pour le nombre total de leucocytes et de plaquettes. Cinq échantillons seront sélectionnés au hasard traités avec de la thrombine bovine reconstituée dans du chlorure de calcium à 10 % et seront évalués pour les facteurs de croissance [facteurs de croissance dérivés des plaquettes (PDGF) et facteurs de croissance endothéliaux vasculaires (VEGF)] par ELISA.

En moyenne, notre échantillon de PRP contiendra 100 milliards de plaquettes et 30 fois le concentré de plaquettes sanguines dans 2 ml de PRP final.

Préparation des exosomes :

Soixante ml de sang dans des tubes revêtus d'EDTA seront centrifugés à 1 200 g pendant 10 minutes à 4°C pour séparer le plasma. Le plasma sera filtré avec un filtre (0,22 μm). Évitez tout matériau en granulés lors du transfert du plasma. Jeter le matériau en granulés. Ce tube a un filtre spécial pour concentrer les exosomes et autres protéines favorisant la croissance. Le tube sera centrifugé à 3000 g, TA, 30 min et les exosomes seront collectés puis seront concentrés (0,5 ml à 3 ml). Pour récupérer les exosomes obstrués dans la paroi du filtre, ajoutez 20 ml de NS (de préférence du PBS) dans un microtube à centrifuger et rincez-le par centrifugation à 3 500 g. Recueillez à nouveau la soupe concentrée d'exosomes qui ont été bouchés dans la paroi du filtre.

La quantification de la teneur en protéines se fera par dosage de l'acide bicinchoninique (BCA).

Analyse de suivi des nanoparticules (NTA) Les suspensions de vésicules avec des concentrations comprises entre 1 × 107/ml et 1 × 109/ml seront examinées à l'aide d'un Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., Royaume-Uni) équipé d'un laser à 405 nm pour déterminer la taille et la quantité de particules isolé. Une vidéo d'une durée de 60 secondes sera prise avec une fréquence d'images de 30 images/seconde, et le mouvement des particules sera analysé à l'aide du logiciel NTA (version 2.3 ; NanoSight Ltd.).

Analyse Western blot Le surnageant de l'exosome sera dénaturé dans un tampon d'échantillon et sera soumis à une analyse western blot. Les exosomes purifiés seront analysés pour l'expression des protéines HSP70, flottiline, CD63, TSG101 et calnexine. Les protéines ont été visualisées sur le système Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Conception de l'étude Les patients seront randomisés en 2 bras avec soit pour recevoir du PRP avec des exosomes au centre du noyau pulpeux ou une quantité égale de placebo et seront évalués par 2 médecins interventionnels de la colonne vertébrale et de la médecine.

Randomisation et bras de l'étude :

Environ trois cents patients seront sélectionnés pour être répartis au hasard dans des groupes de traitement ou de contrôle selon un ratio de 1: 1, afin d'affecter 30 patients dans chacun des 4 bras :

1. Le bras I recevra un placebo (injection au point de déclenchement sous le bras C)

2. Bras II : pour recevoir du PRP avec des exosomes au centre du noyau pulpeux (2 ml) Produit(s) à tester, dose et mode d'administration durée du traitement Les patients seront sélectionnés au hasard en fonction du nombre généré par ordinateur pour recevoir une injection indiscernable de PRP ex ou placebo. Après désinfection cutanée du dos, 2 ml du PRPex total procuré ont été injectés dès que possible par un abord latéral guidé par fluoroscopie. Les patients ont reçu le placebo d'une manière similaire, mais pas pour le disque. sera dans la zone musculaire autour du point de déclenchement. Le médecin qui a évalué l'étude et le patient étaient inconnus du traitement. Les patients ont été invités à poursuivre les exercices habituels, les précautions de routine, la physiothérapie et les soins du dos.

   Le paracétamol (jusqu'à un maximum d'un gramme) trois fois par jour sera autorisé à être utilisé comme médicament de secours. Aucun corticostéroïde systémique, médicament/procédure susceptible de modifier les symptômes ne sera autorisé pendant l'étude.

   Évaluations de l'étude / Mesures des résultats

   1. Échelle visuelle analogique (EVA)
   2. Questionnaire Roland Morris sur le handicap (RDQ)
   3. Questionnaire de santé SF 36
   4. Indice de notation fonctionnelle

   5. IRM - évaluation de la dégénérescence discale, quantification T2 de toute preuve de discite Les patients seront évalués par échelle visuelle analogique (EVA), questionnaire de santé SF 36, indice d'évaluation fonctionnelle au départ et suivi à 1, 3, 6 et 12 mois. L'efficacité structurelle sera évaluée par quantification et gradation IRM t2 comme décrit précédemment dans la littérature au départ et à 6 mois par deux radiologues expérimentés. Les évaluateurs seront en aveugle.

      Les visites de contrôle seront effectuées conformément aux procédures de contrôle standard.

      L'arrêt du traitement pour une raison spécifique sera déterminé. Tout signe d'infection/discite sera délicatement observé. L'aggravation de la douleur sera analysée en profondeur.

      Les patients seront évalués pour tout effet indésirable et signes vitaux une fois par semaine pendant le premier mois, puis une fois par mois jusqu'à 6 mois. Des échantillons de sang ont été prélevés au moment de l'entrée dans l'étude, à six mois, et lors d'une visite finale pour examiner les variables biologiques ainsi que les fonctions hépatique et rénale. La tolérance a été évaluée et des tests hématologiques et biochimiques en laboratoire ont été effectués. Une éventuelle relation causale avec le bras de traitement sera également évaluée.

      ANALYSES STATISTIQUES:

      L'analyse de la variance (ANOVA) sera utilisée pour étudier les différences entre les groupes. Les différences entre les échantillons appariés seront comparées à l'aide du test t de Student bilatéral. Les corrélations entre les variables seront évaluées par la corrélation de Pearson. SPSS 20.0 sera utilisé pour les analyses statistiques (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 sera considéré comme statistiquement significatif.

      Identification de la relation entre les problèmes de sécurité/effets secondaires et le niveau d'excitation à l'aide de mesures par des échelles d'évaluation. Pour tester si la relation entre les problèmes de sécurité/effets secondaires et le niveau d'excitation diffère entre les groupes IBRF ACP/MCP et Standard of Care, en utilisant la mesure par des échelles d'évaluation, deux analyses seront menées. La corrélation canonique sera utilisée pour déterminer quel effet secondaire (ou combinaison d'effets secondaires) explique la variance dans les mesures de l'échelle d'évaluation. De plus, une analyse par grappes sera utilisée pour déterminer si les effets secondaires sont liés de la même manière aux niveaux d'éveil et aux résultats pour les patients des trois groupes de traitement.

      PROCÉDURES DE SURVEILLANCE/ÉVÉNEMENTS INDÉSIRABLES/POINTS FINAUX DE SÉCURITÉ Surveillance Les moniteurs visiteront le centre pendant l'étude en plus de maintenir des communications téléphoniques et écrites fréquentes.

      Les directives suivantes répondent aux exigences spécifiées dans 21 CFR §812.46 et sont fournies pour décrire les procédures de surveillance des études cliniques. Si l'investigateur ne respecte pas l'accord d'investigateur signé, le protocole ou toute condition de l'étude (par exemple, des formulaires de données incomplets), le moniteur a le droit de mettre fin à la participation de l'investigateur à l'étude.

      Procédures de surveillance préalable à l'étude

      La personne désignée (c'est-à-dire moniteur) sera chargé de déterminer et de documenter que chaque chercheur comprend et accepte clairement les responsabilités et les obligations encourues dans la conduite d'une étude clinique. Le moniteur s'assurera avant le début de l'étude que l'investigateur :

      • Comprend les exigences d'une étude bien contrôlée;

      • Comprend la nature du protocole clinique

      • comprend ses obligations de déclaration;

      • Comprend les exigences en matière de responsabilité de l'appareil ;

      • Comprend et accepte les obligations d'obtenir un consentement éclairé conformément à 21 CFR Parties 50 et 56 ;

      • Comprend et accepte l'obligation d'obtenir l'examen et l'approbation de l'IRB de l'investigation clinique avant son lancement et d'assurer un examen continu de l'étude par l'IRB conformément à la partie 56 du 21 CFR, et de tenir le promoteur informé de toutes les actions de l'IRB concernant l'étude;

      • Comprend et accepte les exigences concernant la divulgation financière des investigations cliniques, 21 CFR Part 54 ;
      • Dispose d'installations adéquates et d'un accès à un nombre suffisant de sujets appropriés pour mener l'enquête ;
      • A la documentation requise au dossier, y compris l'approbation de la CISR et un accord d'enquêteur signé.

      Visites de surveillance périodiques • Les visites de surveillance seront effectuées conformément aux directives de la FDA pour la surveillance des investigations cliniques - janvier 1988.

      • Le moniteur doit visiter chaque site régulièrement pour s'assurer que :

      • Les installations continuent d'être adéquates et acceptables.

      • Le protocole est correctement suivi.

      • L'IRB/CEI a approuvé ou a été informé de tout changement de protocole.

      • Des registres exacts, complets et à jour sont conservés et les informations enregistrées.

      • Des rapports d'événements indésirables précis, complets et opportuns sont soumis

      • Le consentement éclairé a été obtenu.

      • La raison du retrait d'un sujet de l'étude a été documentée.

      • Les rapports sont soumis à la CISR et au parrain.

      • Le personnel approprié mène des activités d'étude.

      • Tous les formulaires de rapport de cas et autres documents liés à l'étude seront examinés dès réception, et le site sera rapidement informé de toute lacune.

      Fréquence des visites de contrôle a) Les visites de contrôle seront effectuées conformément aux procédures de contrôle standard. Les visites de contrôle seront déterminées sur la base de plusieurs facteurs, notamment : b) la durée de l'étude ; c) Nombre de questions en suspens des visites précédentes ; d) Nombre de sujets inscrits ; e) nombre d'enquêteurs/sites ; et, f) Complexité de l'étude.

      Fin de l'étude Toutes les fonctions de surveillance de routine doivent être effectuées avant la visite de fin d'étude. La visite de fin d'étude peut être combinée à une visite de suivi. Les tâches suivantes doivent être réalisées lors de la dernière visite du moniteur.

   1. Rappeler à l'enquêteur l'obligation de conserver les dossiers. b) Préparer le rapport final de suivi pour l'IEC.

   Rapports des visites de contrôle

   Des rapports de surveillance doivent être remplis pour toutes les visites. Les rapports doivent inclure les informations suivantes :

   a) Date de la visite ; b) Liste du personnel du site d'étude présent ; c) Un résumé des constatations, des problèmes