椎间盘内注射富含外泌体的富血小板血浆 (PRP) 治疗慢性腰痛

慢性腰痛 (LBP) 的管理促成了其高社会经济性。椎间盘占慢性 LBP 病例的 40% 或更多。 可用的治疗方案并不能改善潜在的退行性疾病，尽管它们确实可以解决其症状。 这表明需要新的疗法和/或干预措施来真正治疗椎间盘源性疼痛的根本原因。 将 PRP 直接注射到纤维环和髓核中的生物疗法似乎是一种有效且可行的选择。

源自血液的外泌体可能会将一些独特的干细胞特性传递给其他干细胞，从而促进干性维持、分化、自我更新和修复。

我们建议进行一项受控、随机、双盲的临床试验，以比较外泌体在 LBP 中的安全性和有效性。 在参与研究之前，将获得所有受试者的知情同意。

PRP准备：

血液样本（60 毫升）将以 600×g 离心 10 分钟以收集血浆部分。 并以 4000×g 离心 15 分钟。 然后除去上清液贫血小板血浆 (PPP)，留下 1 ml PRP。 PPP 将通过一微米的特殊本土设计反冲洗过滤器（Alpha Corpuscle，德里，印度），以便 PPP 部分中存在的所有血小板都将被截留在过滤器中。 这些被捕获的血小板将用 1 ml PPP 冲洗回来以回收大部分血小板。 这将混合在一起，然后通过 WBC 过滤器（Terumo Imuguard，美国）以滤除白细胞。 将分析最终的 PRP 浓缩物 (0.1 ml) 的总白细胞和血小板计数。 将随机选择五个样本，用在 10% 氯化钙中重构的牛凝血酶处理，将通过 ELISA 评估生长因子 [血小板衍生生长因子 (PDGF) 和血管内皮生长因子 (VEGF)]。

平均而言，我们的 PRP 样品将含有 1000 亿个血小板和 2ml 最终 PRP 中 30 倍浓缩的血小板。

外泌体制备：

在 EDTA 涂层管中的 60 毫升血液将在 4°C 下以 1,200 g 离心 10 分钟以分离血浆。 血浆将用 (0.22 μm) 过滤器过滤。 转移血浆时避免任何颗粒状材料。 丢弃颗粒状材料。 该管具有特殊过滤器，可浓缩外泌体和其他促生长蛋白。 将管以 3000 g、室温、30 分钟离心，收集外来体，然后浓缩（0.5 毫升至 3 毫升）。 要回收堵塞在过滤器壁上的外泌体 - 将 20 ml NS（最好是 PBS）添加到微量离心管中，并通过以 3,500 g 离心漂洗。 再次收集滤壁堵塞的外泌体浓缩液。

蛋白质含量的定量将通过二喹啉甲酸 (BCA) 测定法进行。

纳米粒子跟踪分析 (NTA) 使用配备 405 nm 激光的 Nanosight NS300（NanoSight Ltd.，UK）检查浓度在 1×107/ml 和 1×109/ml 之间的囊泡悬浮液，以确定颗粒的大小和数量孤立。 将以 30 帧/秒的帧速率拍摄 60 秒持续时间的视频，并使用 NTA 软件（2.3 版；NanoSight Ltd.）分析粒子运动。

蛋白质印迹分析 外泌体上清液将在样品缓冲液中变性并进行蛋白质印迹分析。 将分析纯化的外泌体的蛋白质表达 HSP70、flottilin、CD63、TSG101 和 calnexin。 蛋白质在 Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager 系统（Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA）上可视化。

研究设计 患者将被随机分为 2 组，接受在髓核中心带有外泌体的 PRP 或等量的安慰剂，并将由 2 名介入性脊柱和内科医师进行评估。

研究的随机化和武器：

将筛选大约 300 名患者，以 1:1 的比例随机分配到治疗组或对照组，每 4 组分配 30 名患者：

1. I 臂将被分配接受安慰剂（C 臂下的触发点注射）

2. 第 II 组：在髓核中心接受带有外泌体的 PRP (2ml) 测试产品、剂量和给药方式 治疗持续时间 将根据计算机生成的数字随机选择患者接受一次无法区分的 PRP ex 注射或安慰剂。 背部皮肤消毒后，从采购的总 PRPex 中抽取 2 毫升，尽快通过荧光镜引导的侧向入路进行注射。 患者以类似的方式接受安慰剂，但不接受安慰剂。 将在触发点周围的肌肉区域。评估研究的医生和患者不知道治疗。 建议患者继续进行常规锻炼、常规预防措施、物理治疗和背部护理。

   扑热息痛（最多一克）一天三次，将被允许用作救援药物。 研究期间不允许使用全身性皮质类固醇、潜在的症状改善药物/程序。

   研究评估/结果测量

   1. 视觉模拟量表 (VAS)
   2. 罗兰·莫里斯残疾问卷 (RDQ)
   3. SF 36健康问卷
   4. 功能评级指标

   5. MRI - 椎间盘退变分级，T2 量化任何椎间盘炎证据 患者将通过视觉模拟量表 (VAS)、SF 36 健康问卷、基线时的功能评级指数进行评估，并在 1、3、6 和 12 个月时进行随访。 结构功效将由两位经验丰富的放射科医师在基线和 6 个月时通过 MRI t2 量化和分级进行评估，如前文所述。 评估员将被蒙蔽。

      监测访问将根据标准监测程序进行。

      将确定因特定原因停止治疗。 将仔细观察任何感染/椎间盘炎的证据。 将深入分析疼痛的恶化。

      患者将在第一个月每周一次评估任何不良反应和生命体征，然后每月一次，最多 6 个月。 在进入研究时、六个月时和最后一次访问时收集血样，以检查生物变量以及肝肾功能。 评估了耐受性并进行了基于实验室的血液学和生化检测。 还将评估与治疗组的可能因果关系。

      统计分析：

      方差分析 (ANOVA) 将用于研究组间差异。 配对样本的差异将使用双尾学生 t 检验进行比较。 变量之间的相关性将通过 Pearson 相关性进行评估。 SPSS 20.0 将用于统计分析（SPSS, Inc., Chicago, IL, USA）。 P<0.05将被认为具有统计学意义。

      使用评级量表测量确定安全问题/副作用与唤醒水平之间的关系。 为了测试安全问题/副作用与唤醒水平之间的关系在 IBRF ACP/MCP 与护理标准组之间是否不同，使用评级量表进行测量，将进行两项分析。 典型相关将用于确定哪种副作用（或副作用的组合）解释了评级量表测量中的方差。 此外，将采用聚类分析来确定副作用是否与三个治疗组患者的唤醒水平和结果有相似的相关性。

      监测程序/不良事件/安全端点监测除了保持频繁的电话和书面交流外，监测员还将在研究期间访问中心。

      以下指南符合 21 CFR §812.46 中规定的要求，用于描述监测临床研究的程序。 如果研究者不遵守签署的研究者协议、协议或研究的任何条件（例如，不完整的数据表），监查员有权终止研究者参与研究。

      研究前监测程序

      候任者（即 监查员）将负责确定并记录每个研究者清楚地理解并接受在进行临床研究中产生的责任和义务。 监查员将确保研究开始前研究者：

      • 了解良好对照研究的要求；

      • 了解临床方案的性质

      • 了解他/她的报告义务；

      • 了解设备问责制的要求；

      • 理解并接受根据 21 CFR 第 50 和 56 部分获得知情同意的义务；

      • 理解并接受在临床研究开始之前获得 IRB 审查和批准的义务，并确保 IRB 根据 21 CFR 第 56 部分对研究进行持续审查，并让发起人了解 IRB 的所有行动研究;

      • 理解并接受有关临床研究财务披露的要求，21 CFR 第 54 部分；
      • 有足够的设施和接触足够数量的合适对象来进行调查；
      • 备有所需文件，包括 IRB 批准和签署的研究者协议。

      定期监测访问 • 监测访问将根据 FDA 临床调查监测指南 - 1988 年 1 月进行。

      • 监督员应定期访问每个站点以确保：

      • 设施仍然充足且可接受。

      • 协议得到正确遵守。

      • IRB/IEC 已批准或获知任何方案变更。

      • 保持准确、完整和最新的记录，并记录信息。

      • 提交准确、完整和及时的不良事件报告

      • 已获得知情同意。

      • 受试者退出研究的原因已记录在案。

      • 报告正在提交给IRB 和发起人。

      • 合适的工作人员正在开展学习活动。

      • 所有病例报告表和其他与研究相关的文件将在收到后进行审查，如有任何不足，将立即通知研究中心。

      监测访问的频率 a) 监测访问将根据标准监测程序进行。 监测访问将根据几个因素确定，包括： b) 研究的持续时间； c) 以往访问中未解决问题的数量； d) 登记的受试者数量； e) 调查员/站点的数量； f) 研究的复杂性。

      研究终止 所有常规监测功能必须在研究终止访问之前执行。 研究终止访视可与监测访视相结合。 以下任务应在监查员最后一次访问时完成。

   1. 提醒调查员有义务保留记录。 b) 为 IEC 准备最终监测报告。

   监测访问报告

   所有访问都必须完成监测报告。 报告必须包含以下信息：

   a) 访问日期； b) 在场的研究现场人员名单； c) 调查结果、问题总结