Eksosomeilla rikastetun verihiutalerikkaan plasman (PRP) injektio levyn sisäpuolelle krooniseen alaselkäkipuun

Kroonisen alaselkäkivun (LBP) hallinta on vaikuttanut sen korkeaan sosioekonomiseen tasoon. Nikamavälilevy aiheuttaa 40 % tai useampia kroonisen LBP:n tapauksia. Saatavilla olevat hoitovaihtoehdot eivät paranna taustalla olevaa rappeuttavaa tilaa, vaikka ne ratkaisevat sen oireita. Tämä osoittaa, että tarvitaan uusia hoitoja ja/tai interventioita, jotka todella hoitavat diskogeenisen kivun taustalla olevia syitä. Biologiset hoidot injektoimalla PRP:tä suoraan annulus fibrosukseen ja nucleus pulposukseen vaikuttavat tehokkaalta ja käyttökelpoiselta vaihtoehdolta.

Verestä peräisin olevat eksosomit voivat mahdollisesti siirtää joitakin ainutlaatuisia kantasoluominaisuuksia muihin kantasoluihin, mikä helpottaa kantasolujen ylläpitoa, erilaistumista, itsensä uusiutumista ja korjausta.

Ehdotamme kontrolloitua, satunnaistettua, kaksoissokkoutettua kliinistä tutkimusta eksosomien turvallisuuden ja tehokkuuden vertailemiseksi LBP:ssä. Kaikilta koehenkilöiltä hankitaan tietoinen suostumus ennen tutkimukseen osallistumista.

PRP:n valmistus:

Verinäyte (60 ml) sentrifugoidaan nopeudella 600 x g 10 minuuttia plasmafraktion keräämiseksi. Ja sentrifugoitiin 4000 x g:llä 15 minuuttia. Supernatantti verihiutalehuono plasma (PPP) poistetaan sitten, jolloin jäljelle jää 1 ml PRP. PPP johdetaan yhden mikronin erityisen alkuperäiskansojen suunnitellun huuhtelusuodattimen (Alpha Corpuscle, Delhi, Intia) läpi, jotta kaikki PPP-fraktiossa olevat verihiutaleet jäävät loukkuun suodattimeen. Nämä loukkuun jääneet verihiutaleet huuhdellaan takaisin 1 ml:lla PPP:tä, jotta suurin osa verihiutaleista saadaan talteen. Tämä sekoitetaan yhteen ja viedään sitten WBC-suodattimen (Terumo Imuguard, USA) läpi leukosyyttien suodattamiseksi. Lopullisesta PRP-konsentraatista (0,1 ml) analysoidaan leukosyyttien ja verihiutaleiden kokonaismäärä. Viisi näytettä valitaan satunnaisesti, ja niitä käsitellään naudan trombiinilla, joka on liuotettu uudelleen 10-prosenttiseen kalsiumkloridiin. Kasvutekijät [verihiutaleperäiset kasvutekijät (PDGF) ja verisuonten endoteelikasvutekijät (VEGF)] arvioidaan ELISA-menetelmällä.

PRP-näytteessämme on keskimäärin 100 miljardia verihiutaletta ja 30x verihiutalekonsentraatti 2 ml:ssa lopullista PRP:tä.

Eksosomien valmistus:

Kuusikymmentä ml verta EDTA-päällystetyissä putkissa pyöritetään 1 200 g:ssa 10 minuuttia 4 °C:ssa plasman erottamiseksi. Plasma suodatetaan (0,22 μm) suodattimella. Vältä pelletoitua materiaalia plasmaa siirtäessäsi. Hävitä pelletoitu materiaali. Tässä putkessa on erityinen suodatin eksosomien ja muiden kasvua edistävien proteiinien keskittämiseksi. Putki sentrifugoidaan 3 000 g:ssä, huoneenlämpötilassa, 30 minuuttia ja eksosomit kerätään ja sitten konsentroidaan (0,5 ml - 3 ml). Suodattimen seinämään tukkeutuneiden eksosomien talteenottamiseksi -lisää 20 ml NS:ää (mieluiten PBS:ää) mikrosentrifugiputkeen ja huuhtele se sentrifugoimalla 3500 g:llä. Kerää uudelleen tiivistetty keitto eksosomeista, jotka olivat tukkeutuneet suodattimen seinämään.

Proteiinipitoisuuden kvantifiointi tehdään bikinkoniinihappo (BCA) -määrityksellä.

Nanohiukkasten seurantaanalyysi (NTA) Vesikkelisuspensiot, joiden pitoisuus on välillä 1 × 107/ml - 1 × 109/ml, tutkitaan käyttämällä Nanosight NS300 -laitetta (NanoSight Ltd., UK), joka on varustettu 405 nm:n laserilla hiukkasten koon ja määrän määrittämiseksi. eristetty. 60 sekuntia kestävä video otetaan kuvanopeudella 30 kuvaa/s ja hiukkasten liike analysoidaan NTA-ohjelmistolla (versio 2.3; NanoSight Ltd.).

Western blot -analyysi Eksosomin supernatantti denaturoidaan näytepuskurissa ja sille suoritetaan Western blot -analyysi. Puhdistetut eksosomit analysoidaan proteiiniekspression HSP70, flottiliini, CD63, TSG101 ja kalneksiinin suhteen. Proteiinit visualisoitiin Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager -järjestelmällä (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Tutkimussuunnitelma Potilaat satunnaistetaan kahteen haaraan, joista joko saavat PRP:tä eksosomeilla nucleus pulposuksen keskellä tai yhtä paljon lumelääkettä, ja 2 interventio-selkä- ja lääkelääkäriä arvioi heidät.

Satunnaistaminen ja tutkimuksen osat:

Noin kolmesataa potilasta seulotaan, jotta ne jaetaan satunnaisesti hoito- tai kontrolliryhmiin suhteessa 1:1, jolloin kuhunkin neljään haaraan jaetaan 30 potilasta:

1. Käsivarsi I määrätään saamaan lumelääkettä (liipaisupisteinjektio C-käsivarren alle)

2. Käsivarsi II: saada PRP eksosomeilla nucleus pulposuksen keskellä (2 ml) Testivalmiste(t), annos ja antotapa hoidon kesto Potilaat valitaan satunnaisesti tietokoneella luodun määrän perusteella, jotka saavat yhden erottamattoman PRP-injektion ex. tai lumelääkettä. Selän ihon desinfioinnin jälkeen 2 ml hankitusta PRPex-määrästä injektoitiin mahdollisimman pian fluoroskopiaohjatulla lateraalisella lähestymistavalla. Potilaat saivat lumelääkettä samalla tavalla, mutta eivät levyttäneet sitä tulee olemaan liipaisupisteen ympärillä olevalla lihasalueella. Tutkimuksen arvioinut lääkäri ja potilas eivät olleet tiedossa hoidosta. Potilaita kehotettiin jatkamaan tavanomaisia ​​harjoituksia, rutiininomaisia ​​varotoimenpiteitä, fysioterapiaa ja selänhoitoa.

   Parasetamolia (enintään grammaan) kolme kertaa päivässä saa käyttää pelastuslääkkeenä. Mitään systeemistä kortikosteroidia, mahdollista oireita muuttavaa lääkettä/toimenpidettä ei sallita tutkimuksen aikana.

   Tutkimusarviot / Tulosmittaukset

   1. Visuaalinen analoginen asteikko (VAS)
   2. Roland Morris Disability Questionnaire (RDQ)
   3. SF 36 terveyskysely
   4. Toiminnallinen luokitusindeksi

   5. MRI - levyn degeneraation luokitus, T2-kvantifiointi kaikki todisteet diskiitistä Potilaat arvioidaan visuaalisen analogisen asteikon (VAS), SF 36 -terveyskyselyn, toiminnallisen luokitusindeksin avulla ja niitä seurataan 1, 3, 6 ja 12 kuukauden kuluttua. Rakenteellinen tehokkuus arvioidaan MRI-t2-kvantifioinnilla ja luokittelulla, kuten aiemmin kirjallisuudessa on kuvattu lähtötilanteessa ja 6 kuukauden kuluttua kahden kokeneen radiologin toimesta. Arvioijat sokeutuvat.

      Tarkkailukäynnit tehdään vakiovalvontamenettelyjen mukaisesti.

      Hoidon lopettaminen erityisestä syystä selvitetään. Kaikki todisteet infektiosta/levytulehduksesta tarkkaillaan huolellisesti. Kivun paheneminen analysoidaan syvällisesti.

      Potilaat arvioidaan haitallisten vaikutusten ja elintoimintojen varalta kerran viikossa ensimmäisen kuukauden ajan ja sitten kerran kuukaudessa 6 kuukauden ajan. Verinäytteet otettiin tutkimukseen tullessa, kuuden kuukauden kuluttua ja viimeisellä käynnillä biologisten muuttujien sekä maksan ja munuaisten toiminnan tutkimiseksi. Sietävyys arvioitiin ja laboratoriopohjaiset hematologiset ja biokemialliset määritykset suoritettiin. Myös mahdollinen syy-yhteys hoitoryhmään arvioidaan.

      TILASTOLLINEN ANALYYSI:

      Varianssianalyysiä (ANOVA) käytetään ryhmien välisten erojen tutkimiseen. Parinäytteiden eroja verrataan käyttämällä kaksisuuntaista Studentin t-testiä. Muuttujien väliset korrelaatiot arvioidaan Pearsonin korrelaatiolla. Tilastollisiin analyyseihin käytetään SPSS 20.0:aa (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 katsotaan tilastollisesti merkitseväksi.

      Turvallisuusongelmien/sivuvaikutusten ja kiihottumistason välisen suhteen tunnistaminen mittausasteikkojen avulla. Sen testaamiseksi, eroaako turvallisuusongelmien/sivuvaikutusten ja kiihottumistason välinen suhde IBRF ACP/MCP vs. Standard of Care -ryhmien välillä käyttämällä arviointiasteikkojen mittausta, suoritetaan kaksi analyysiä. Kanonista korrelaatiota käytetään määrittämään, mikä sivuvaikutus (tai sivuvaikutusten yhdistelmä) selittää varianssin luokitusasteikon mittauksissa. Lisäksi käytetään klusterianalyysiä sen määrittämiseksi, liittyvätkö sivuvaikutukset samalla tavalla kolmen hoitoryhmän potilaiden kiihottumisen tasoon ja tuloksiin.

      SEURANTAMENETELMÄT/HAITTAVAT TAPAHTUMAT / TURVALLISUUSOHJEET Valvonta Tarkkailijat vierailevat keskuksessa tutkimuksen aikana säännöllisen puhelin- ja kirjallisen yhteydenpidon lisäksi.

      Seuraavat ohjeet täyttävät 21 CFR §812.46:ssa määritellyt vaatimukset ja ne on tarkoitettu kuvaamaan kliinisten tutkimusten seurantamenettelyjä. Jos tutkija ei noudata allekirjoitettua tutkijasopimusta, protokollaa tai mitä tahansa tutkimuksen ehtoa (esim. puutteelliset tietolomakkeet), monitorilla on oikeus lopettaa tutkijan osallistuminen tutkimukseen.

      Tutkimusta edeltävät seurantamenettelyt

      Nimitys (esim. monitori) on vastuussa sen määrittämisestä ja dokumentoinnista, että jokainen tutkija ymmärtää selvästi ja hyväksyy kliinisen tutkimuksen suorittamiseen liittyvät vastuut ja velvollisuudet. Monitori varmistaa ennen tutkimuksen aloittamista, että tutkija:

      • Ymmärtää hyvin kontrolloidun tutkimuksen vaatimukset;

      • Ymmärtää kliinisen protokollan luonteen

      • Ymmärtää raportointivelvollisuutensa;

      • Ymmärtää laitevastuun vaatimukset;

      • Ymmärtää ja hyväksyy velvollisuudet hankkia tietoinen suostumus 21 CFR:n osien 50 ja 56 mukaisesti;

      • Ymmärtää ja hyväksyy velvoitteen hankkia IRB-arviointi ja -hyväksyntä kliiniselle tutkimukselle ennen sen aloittamista ja varmistaa, että IRB suorittaa tutkimuksen jatkuvan tarkastelun 21 CFR:n osan 56 mukaisesti, ja pitää toimeksiantajan ajan tasalla kaikista IRB-toimista, jotka koskevat tutkimus;

      • Ymmärtää ja hyväksyy kliinisten tutkimusten taloudellista julkistamista koskevat vaatimukset, 21 CFR Part 54;
      • hänellä on riittävät tilat ja pääsy riittävään määrään sopivia aiheita tutkimuksen suorittamiseksi;
      • Hänellä on tarvittavat asiakirjat, mukaan lukien IRB-hyväksyntä ja allekirjoitettu tutkijasopimus.

      Säännölliset seurantakäynnit • Tarkkailukäynnit suoritetaan FDA:n ohjeiden mukaisesti kliinisten tutkimusten seurantaa varten - tammikuu 1988.

      • Monitorin tulee käydä jokaisessa paikassa säännöllisesti varmistaakseen seuraavat asiat:

      • Tilat ovat edelleen riittäviä ja hyväksyttäviä.

      • Protokollaa noudatetaan oikein.

      • IRB/IEC on hyväksynyt kaikki protokollamuutokset tai niille on ilmoitettu niistä.

      • Tarkkoja, täydellisiä ja ajantasaisia ​​tietueita ylläpidetään ja tiedot tallennetaan.

      • Tarkat, täydelliset ja oikea-aikaiset haittatapahtumaraportit toimitetaan

      • Tietoinen suostumus on saatu.

      • Syy koehenkilön tutkimuksesta vetäytymiseen on dokumentoitu.

      • Raportit toimitetaan IRB:lle ja sponsorille.

      • Asianmukainen henkilökunta suorittaa opintotoimintaa.

      • Kaikki tapausraporttilomakkeet ja muu tutkimukseen liittyvä dokumentaatio käydään läpi niiden vastaanottamisen yhteydessä ja puutteista ilmoitetaan viipymättä toimipaikalle.

      Tarkkailukäyntien tiheys a) Tarkkailukäynnit tehdään tavanomaisten valvontamenettelyjen mukaisesti. Tarkkailukäynnit määräytyvät useiden tekijöiden perusteella, mukaan lukien: b) tutkimuksen kesto; c) Aiempien käyntien ratkaisemattomien ongelmien määrä; d) ilmoittautuneiden koehenkilöiden lukumäärä; e) tutkijoiden/toimipaikkojen lukumäärä; ja f) tutkimuksen monimutkaisuus.

      Tutkimuksen lopettaminen Kaikki rutiinitarkkailutoiminnot on suoritettava ennen tutkimuksen lopetuskäyntiä. Tutkimuksen lopetuskäynti voidaan yhdistää seurantakäyntiin. Seuraavat tehtävät tulee suorittaa monitorin viimeisellä käynnillä.

   1. Muistuta tutkijaa velvollisuudesta säilyttää asiakirjat. b) Valmistele lopullinen valvontaraportti IEC:lle.

   Raportit seurantakäynneistä

   Valvontaraportit on laadittava kaikista käynneistä. Raporttien tulee sisältää seuraavat tiedot:

   a) Vierailun päivämäärä; b) Luettelo läsnäolevasta tutkimuspaikan henkilöstöstä; c) Yhteenveto havainnoista, ongelmista