Dokręgosłupowe wstrzyknięcie osocza bogatopłytkowego (PRP) wzbogaconego egzosomami w przewlekłym bólu krzyża

Zarządzanie przewlekłym bólem krzyża (LBP) przyczyniło się do jego wysokiego społeczno-ekonomicznego Krążek międzykręgowy odpowiada za 40% lub więcej przypadków przewlekłego LBP. Dostępne opcje leczenia nie poprawiają stanu zwyrodnieniowego, chociaż łagodzą jego objawy. Wskazuje to na potrzebę nowych terapii i/lub interwencji, które faktycznie leczą podstawowe przyczyny bólu dyskogennego. Terapie biologiczne poprzez bezpośrednią iniekcję PRP do pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego wydają się skuteczną i wykonalną opcją.

Egzosomy pochodzące z krwi mogą potencjalnie przenosić niektóre unikalne właściwości komórek macierzystych na inne komórki macierzyste, ułatwiając utrzymanie, różnicowanie, samoodnawianie i naprawę macierzystych komórek.

Proponujemy przeprowadzenie kontrolowanego, randomizowanego, podwójnie ślepego badania klinicznego w celu porównania bezpieczeństwa i skuteczności egzosomów w LBP. Świadoma zgoda zostanie uzyskana od wszystkich uczestników przed udziałem w badaniu.

Przygotowanie wstępne:

Próbkę krwi (60 ml) odwiruje się przy 600 x g przez 10 minut w celu zebrania frakcji osocza. I wirowano przy 4000 x g przez 15 min. Supernatant osocza ubogiego w płytki krwi (PPP) zostanie następnie usunięty, pozostawiając 1 ml PRP. PPP zostanie przepuszczony przez jeden mikron, specjalny, miejscowo zaprojektowany filtr zwrotny (Alpha Corpuscle, Delhi, Indie), tak aby wszystkie płytki obecne we frakcji PPP zostały uwięzione w filtrze. Te uwięzione płytki krwi zostaną z powrotem przepłukane 1 ml PPP w celu odzyskania większości płytek krwi. Zostanie to zmieszane razem, a następnie przepuszczone przez filtr WBC (Terumo Imuguard, USA) w celu odfiltrowania leukocytów. Końcowy koncentrat PRP (0,1 ml) będzie analizowany pod kątem całkowitej liczby leukocytów i płytek krwi. Pięć losowo wybranych próbek poddanych działaniu trombiny bydlęcej rozpuszczonej w 10% chlorku wapnia zostanie ocenionych pod kątem czynników wzrostu [płytkopochodnych czynników wzrostu (PDGF) i czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)] za pomocą testu ELISA.

Średnio nasza próbka PRP będzie zawierała 100 miliardów płytek krwi i 30-krotny koncentrat płytek krwi w 2 ml końcowego PRP.

Przygotowanie egzosomów:

Sześćdziesiąt ml krwi w probówkach pokrytych EDTA będzie wirować przy 1200 g przez 10 minut w temperaturze 4°C w celu oddzielenia osocza. Osocze zostanie przefiltrowane przez filtr (0,22 μm). Podczas przenoszenia osocza należy unikać osadzania się materiału. Wyrzucić granulowany materiał. Ta probówka ma specjalny filtr do koncentracji egzosomów i innych białek promujących wzrost. Probówka zostanie odwirowana przy 3000 g, RT, 30 min, a egzosomy zostaną zebrane, a następnie zatężone (0,5 ml do 3 ml). W celu odzyskania egzosomów zablokowanych w ściankach filtra należy dodać 20 ml NS (najlepiej PBS) do probówki mikrowirówkowej i przepłukać przez wirowanie przy 3500 g. Zbierz ponownie skoncentrowaną zupę egzosomów, które zostały zatkane w ściance filtra.

Oznaczenie ilościowe zawartości białka zostanie przeprowadzone za pomocą oznaczenia kwasu bicynchoniowego (BCA).

Analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA) Zawiesiny pęcherzyków o stężeniach pomiędzy 1×107/ml a 1×109/ml będą badane za pomocą Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., Wielka Brytania) wyposażonego w laser 405 nm w celu określenia rozmiaru i ilości cząstek odosobniony. Zostanie nagrany 60-sekundowy film wideo z szybkością klatek 30 klatek na sekundę, a ruch cząstek zostanie przeanalizowany przy użyciu oprogramowania NTA (wersja 2.3; NanoSight Ltd.).

Analiza Western blot Supernatant egzosomu zostanie zdenaturowany w buforze do próbek i zostanie poddany analizie Western blot. Oczyszczone egzosomy będą analizowane pod kątem ekspresji białek HSP70, flottyliny, CD63, TSG101 i kalneksyny. Białka wizualizowano w systemie Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Projekt badania Pacjenci zostaną losowo przydzieleni do 2 ramion, które otrzymają PRP z egzosomami w centrum jądra miażdżystego lub taką samą ilość placebo i zostaną ocenione przez 2 interwencyjnych lekarzy zajmujących się kręgosłupem i medycyny.

Randomizacja i ramiona badania:

Około 300 pacjentów zostanie poddanych badaniu przesiewowemu w celu losowego przydzielenia do grup terapeutycznych lub kontrolnych w stosunku 1:1, aby przypisać 30 pacjentów do każdego z 4 ramion:

1. Ramię I zostanie przydzielone do otrzymywania placebo (wstrzyknięcie punktu spustowego pod ramieniem C)

2. Ramię II: do podania PRP z egzosomami w centrum jądra miażdżystego (2ml) Produkt(y) badany(e), dawka i sposób podawania czas trwania leczenia Pacjenci zostaną losowo wybrani na podstawie wygenerowanej komputerowo liczby, aby otrzymać jedną nierozróżnialną iniekcję PRP ex lub placebo. Po zdezynfekowaniu skóry pleców 2 ml z całego pobranego PRPex wstrzyknięto tak szybko, jak to możliwe, z dostępu bocznego pod kontrolą fluoroskopii. Pacjenci otrzymywali placebo w podobny sposób, ale bez wskazywania będzie w strefie mięśni wokół punktu spustowego. Lekarz, który oceniał badanie, i pacjent nie znali leczenia. Pacjentom zalecono kontynuowanie zwykłych ćwiczeń, rutynowych środków ostrożności, fizjoterapii i pielęgnacji pleców.

   Paracetamol (maksymalnie do jednego grama) trzy razy dziennie będzie dopuszczony do stosowania jako lek ratunkowy. Podczas badania nie będzie dozwolony żaden kortykosteroid o działaniu ogólnoustrojowym, lek/procedura potencjalnie modyfikująca objawy.

   Oceny badań / Miary wyników

   1. Wizualna skala analogowa (VAS)
   2. Kwestionariusz niepełnosprawności Rolanda Morrisa (RDQ)
   3. Kwestionariusz zdrowotny SF 36
   4. Wskaźnik oceny funkcjonalnej

   5. MRI – stopień zwyrodnienia krążka międzykręgowego, ocena ilościowa T2 wszelkie objawy zapalenia krążka międzykręgowego Pacjenci zostaną ocenieni za pomocą wizualnej skali analogowej (VAS), kwestionariusza zdrowia SF 36, wskaźnika oceny czynnościowej na początku badania i obserwacji po 1, 3, 6 i 12 miesiącach. Skuteczność strukturalna zostanie oceniona przez ocenę ilościową i ocenę t2 MRI, jak opisano wcześniej w literaturze, na początku badania i po 6 miesiącach przez dwóch doświadczonych radiologów. Asesorzy zostaną zaślepieni.

      Wizyty monitorujące będą przeprowadzane zgodnie ze standardowymi procedurami monitoringowymi.

      Przerwanie leczenia z konkretnego powodu zostanie ustalone. Wszelkie oznaki infekcji/zapalenia dysku będą uważnie obserwowane. Nasilenie bólu zostanie dogłębnie przeanalizowane.

      Pacjenci będą oceniani pod kątem działań niepożądanych i parametrów życiowych raz w tygodniu przez pierwszy miesiąc, a następnie raz w miesiącu do 6 miesięcy. Próbki krwi pobrano w momencie rozpoczęcia badania, po sześciu miesiącach, oraz podczas ostatniej wizyty w celu zbadania zmiennych biologicznych, a także funkcji wątroby i nerek. Oceniono tolerancję i przeprowadzono laboratoryjne testy hematologiczne i biochemiczne. Oceniony zostanie również możliwy związek przyczynowy z grupą leczoną.

      ANALIZA STATYSTYCZNA:

      Analiza wariancji (ANOVA) zostanie wykorzystana do zbadania różnic między grupami. Różnice w sparowanych próbach zostaną porównane za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. Korelacje między zmiennymi zostaną ocenione za pomocą korelacji Pearsona. SPSS 20.0 będzie używany do analiz statystycznych (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 będzie uważane za statystycznie istotne.

      Identyfikacja związku między kwestiami bezpieczeństwa/skutkami ubocznymi a poziomem pobudzenia za pomocą pomiaru za pomocą skal ocen. Aby sprawdzić, czy związek między kwestiami bezpieczeństwa/skutkami ubocznymi a poziomem pobudzenia różni się między grupami IBRF ACP/MCP a grupami Standard of Care, przy użyciu skali oceny, zostaną przeprowadzone dwie analizy. Korelacja kanoniczna zostanie wykorzystana do określenia, który efekt uboczny (lub kombinacja efektów ubocznych) wyjaśnia wariancję pomiarów skali ocen. Dodatkowo zostanie zastosowana analiza skupień w celu ustalenia, czy skutki uboczne są podobnie powiązane z poziomami pobudzenia i wynikami u pacjentów w trzech grupach terapeutycznych.

      PROCEDURY MONITOROWANIA / ZDARZENIA NIEPOŻĄDANE / PUNKTY KOŃCOWE DOTYCZĄCE BEZPIECZEŃSTWA Monitorowanie Monitorujący będą odwiedzać ośrodek podczas badania, oprócz utrzymywania częstej komunikacji telefonicznej i pisemnej.

      Poniższe wytyczne spełniają wymagania określone w 21 CFR §812.46 i mają na celu opisanie procedur monitorowania badań klinicznych. Jeśli badacz nie przestrzega podpisanej Umowy z badaczem, protokołu lub jakiegokolwiek warunku badania (np. niekompletne formularze danych), monitor ma prawo zakończyć udział badacza w badaniu.

      Procedury monitorowania przed badaniem

      Desygnowany (tj. monitorujący) będzie odpowiedzialny za ustalenie i udokumentowanie, że każdy badacz wyraźnie rozumie i akceptuje odpowiedzialność i obowiązki związane z prowadzeniem badania klinicznego. Monitor zapewni przed rozpoczęciem badania, że ​​badacz:

      • Rozumie wymagania dobrze kontrolowanego badania;

      • Rozumie naturę protokołu klinicznego

      • Rozumie swoje obowiązki sprawozdawcze;

      • Rozumie wymagania dotyczące odpowiedzialności urządzenia;

      • Rozumie i akceptuje zobowiązania do uzyskania świadomej zgody zgodnie z 21 CFR Części 50 i 56;

      • Rozumie i akceptuje obowiązek uzyskania przeglądu i zatwierdzenia badania klinicznego przez IRB przed jego rozpoczęciem oraz zapewnienia ciągłej oceny badania przez IRB zgodnie z 21 CFR część 56, a także informowania sponsora o wszystkich działaniach IRB dotyczących badania;

      • Rozumie i akceptuje wymagania dotyczące ujawniania informacji finansowych z badań klinicznych, 21 CFR część 54;
      • ma odpowiednie zaplecze i dostęp do odpowiedniej liczby odpowiednich podmiotów do prowadzenia dochodzenia;
      • Posiada wymaganą dokumentację w aktach, w tym zgodę IRB i podpisaną umowę z badaczem.

      Okresowe wizyty kontrolne • Wizyty kontrolne będą przeprowadzane zgodnie z wytycznymi FDA dotyczącymi monitorowania badań klinicznych — styczeń 1988 r.

      • Monitor powinien regularnie odwiedzać każdą placówkę, aby upewnić się, że:

      • Wyposażenie jest nadal odpowiednie i akceptowalne.

      • Protokół jest właściwie przestrzegany.

      • IRB/IEC zatwierdziła lub została powiadomiona o wszelkich zmianach w protokole.

      • Prowadzona jest dokładna, kompletna i aktualna dokumentacja, a informacje są rejestrowane.

      • Składane są dokładne, kompletne i terminowe raporty o zdarzeniach niepożądanych

      • Uzyskano świadomą zgodę.

      • Powód wycofania się uczestnika z badania został udokumentowany.

      • Raporty są składane do IRB i sponsora.

      • Odpowiedni personel prowadzi działalność naukową.

      • Wszystkie formularze opisów przypadków i inna dokumentacja związana z badaniem zostaną sprawdzone po otrzymaniu, a ośrodek zostanie niezwłocznie powiadomiony o wszelkich brakach.

      Częstotliwość wizyt monitorujących a) Wizyty monitorujące będą przeprowadzane zgodnie ze standardowymi procedurami monitorowania. Wizyty monitorujące będą ustalane na podstawie kilku czynników, w tym: b) Czas trwania badania; c) Liczba nierozstrzygniętych kwestii z poprzednich wizyt; d) Liczba zapisanych przedmiotów; e) Liczba badaczy/ośrodków; oraz f) Złożoność badania.

      Zakończenie badania Wszystkie rutynowe funkcje monitorowania należy wykonać przed wizytą końcową badania. Wizyta kończąca badanie może być połączona z wizytą monitorującą. Poniższe zadania powinny zostać wykonane podczas ostatniej wizyty monitorującego.

   1. Przypomnij badaczowi o obowiązku zachowania dokumentacji. b) Przygotuj końcowy raport z monitoringu dla IEC.

   Sprawozdania z wizyt monitorujących

   W przypadku wszystkich wizyt należy sporządzić raporty z monitoringu. Sprawozdania muszą zawierać następujące informacje:

   a) Data wizyty; b) Lista obecnego personelu ośrodka badawczego; c) Podsumowanie ustaleń, problemów