Intradiskal injektion av blodplättsrik plasma (PRP) berikad med exosomer vid kronisk ländryggssmärta

Hantering av kronisk ländryggssmärta (LBP) har bidragit till dess höga socioekonomiska. Den intervertebrala disken står för 40 % eller fler fall av kronisk LBP. Tillgängliga behandlingsalternativ förbättrar inte det underliggande degenerativa tillståndet, även om de löser dess symtom. Detta indikerar behovet av nya terapier och/eller interventioner som faktiskt behandlar de bakomliggande orsakerna till diskogen smärta. Biologiska terapier genom direkt injektion av PRP i annulus fibrosus och nucleus pulposus verkar vara ett effektivt och genomförbart alternativ.

Exosomer som härrör från blod kan potentiellt överföra några av de unika stamcellsegenskaperna till andra stamceller, vilket underlättar stamness underhåll, differentiering, självförnyelse och reparation.

Vi föreslår att ha en kontrollerad, randomiserad, dubbelblind klinisk prövning för att jämföra säkerheten och effekten av exosomer i LBP. Informerat samtycke kommer att erhållas från alla försökspersoner innan studiedeltagandet.

PRP-förberedelser:

Blodprov (60 ml) kommer att centrifugeras vid 600×g i 10 minuter för att samla plasmafraktionen. Och centrifugerade vid 4000×g i 15 min. Supernatant blodplättsfattig plasma (PPP) kommer sedan att avlägsnas och lämnar 1 ml PRP. PPP kommer att passera genom ett-mikrons speciellt inhemskt designat spolfilter (Alpha Corpuscle, Delhi, Indien) så att alla blodplättar som finns i PPP-fraktionen kommer att fångas i filtret. Dessa fångade blodplättar kommer att spolas tillbaka med 1 ml PPP för att få tillbaka de flesta av blodplättarna. Detta kommer att blandas ihop och sedan passera genom ett WBC-filter (Terumo Imuguard, USA) för att filtrera bort leukocyterna. Det slutliga PRP-koncentratet (0,1 ml) kommer att analyseras för totalt antal leukocyter och trombocyter. Fem prover kommer att väljas ut slumpmässigt behandlade med bovint trombin rekonstituerat i 10 % kalciumklorid kommer att bedömas för tillväxtfaktorer [trombocythärledda tillväxtfaktorer (PDGF) och vaskulära endotelial tillväxtfaktorer (VEGF)] med ELISA.

I genomsnitt kommer vårt PRP-prov att ha 100 miljarder blodplättar och 30x koncentrat av blodplättar i 2ml slutlig PRP.

Exosomer förberedelse:

Sextio ml blod i EDTA-belagda rör centrifugeras vid 1 200 g i 10 minuter vid 4°C för att separera plasma. Plasma kommer att filtreras med (0,22 μm) filter. Undvik pelleterat material när plasmat överförs. Kassera det pelleterade materialet. Detta rör har ett speciellt filter för att koncentrera exosomer och andra tillväxtfrämjande proteiner. Röret kommer att centrifugeras vid 3000 g, RT, 30 minuter och exosomer kommer att samlas upp och sedan koncentreras (0,5 ml till 3 ml). För att återvinna exosomer som är tilltäppta i filterväggen - tillsätt 20 ml NS (helst PBS) i mikrocentrifugröret och skölj det genom centrifugering vid 3 500 g. Samla upp den koncentrerade soppan av exosomer igen som var igensatta i filterväggen.

Kvantifiering av proteininnehåll kommer att göras genom bicinchoninsyra (BCA) analys.

Nanopartikelspårningsanalys (NTA) Vesikelsuspensioner med koncentrationer mellan 1×107/ml och 1×109/ml kommer att undersökas med en Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., UK) utrustad med en 405 nm laser för att bestämma storleken och mängden partiklar isolerat. En video på 60 sekunder kommer att tas med en bildhastighet på 30 bilder/sekund, och partikelrörelser kommer att analyseras med hjälp av NTA-programvara (version 2.3; NanoSight Ltd.).

Western blot-analys Exosomsupernatanten kommer att denatureras i provbuffert och kommer att utsättas för Western blot-analys. Renade exosomer kommer att analyseras för proteinuttryck HSP70, flottilin, CD63, TSG101 och calnexin. Proteinerna visualiserades på Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager-systemet (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Studiedesign Patienter kommer att randomiseras till 2 armar med antingen PRP med exosomer i mitten av nucleus pulposus eller lika stor mängd placebo och kommer att utvärderas av 2 interventionella ryggrads- och medicinläkare.

Randomisering och armar av studien:

Cirka trehundra patienter kommer att screenas för att slumpmässigt fördelas till behandlings- eller kontrollgrupper i förhållandet 1:1, för att tilldela 30 patienter i varje 4-arm:

1. Arm I kommer att tilldelas placebo (triggerpunktsinjektion under C-armen)

2. Arm II: att ta emot PRP med exosomer i mitten av nucleus pulposus (2ml) Testprodukt(er), dos och administreringssätt behandlingens varaktighet Patienterna kommer att väljas slumpmässigt baserat på datorgenererat antal för att få en oskiljbar injektion av PRP ex. eller placebo. Efter huddesinfektion av ryggen injicerades 2 ml av den totala PRPex som tagits fram så snart som möjligt genom en fluoroskopistyrd lateral strategi. Patienterna fick placebo på ett liknande sätt men inte till skivan kommer att vara i muskelzonen runt triggerpunkten. Läkaren som utvärderade studien och patienten var okända för behandling. Patienterna fick rådet att fortsätta med vanliga övningar, rutinmässiga försiktighetsåtgärder, sjukgymnastik och ryggvård.

   Paracetamol (upp till max ett gram) tre gånger om dagen kommer att tillåtas användas som räddningsläkemedel. Inga systemiska kortikosteroider, potentiellt symtommodifierande läkemedel/förfarande kommer att tillåtas under studien.

   Studiebedömningar / Resultatmått

   1. Visuell analog skala (VAS)
   2. Roland Morris Disability Questionnaire (RDQ)
   3. SF 36 hälsoenkät
   4. Funktionellt betygsindex

   5. MRT - gradering av diskdegeneration, T2-kvantifiering alla tecken på diskit Patienter kommer att bedömas med visuell analog skala (VAS), SF 36 hälsofrågeformulär, funktionellt betygsindex vid baslinjen och följs efter 1, 3, 6 och 12 månader. Den strukturella effekten kommer att utvärderas genom MRI t2 kvantifiering och gradering som beskrivits tidigare i litteraturen vid baslinjen och efter 6 månader av två erfarna radiologer. Bedömare kommer att förblindas.

      Övervakningsbesök kommer att genomföras i enlighet med vanliga övervakningsförfaranden.

      Avbrytande av behandlingen med en specifik anledning kommer att fastställas. Alla tecken på infektion/diskitis kommer att observeras noggrant. Försämring av smärta kommer att analyseras djupt.

      Patienterna kommer att utvärderas för eventuella biverkningar och vitala tecken en gång i veckan under den första månaden och sedan en gång i månaden upp till 6 månader. Blodprover samlades in vid tidpunkten för inträde i studien, vid sex månader, och vid ett sista besök för att undersöka biologiska variabler samt lever- och njurfunktioner. Tolerabiliteten bedömdes och laboratoriebaserade hematologiska och biokemiska analyser utfördes. Ett eventuellt orsakssamband med behandlingsarmen kommer också att bedömas.

      STATISTISK ANALYS:

      Variansanalys (ANOVA) kommer att användas för att undersöka skillnaderna mellan grupper. Skillnader i parade prover kommer att jämföras med det tvåsidiga Students t-test. Korrelationer mellan variabler kommer att bedömas med Pearsons korrelation. SPSS 20.0 kommer att användas för statistiska analyser (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 kommer att anses vara statistiskt signifikant.

      Identifiering av sambandet mellan säkerhetsfrågor/biverkningar och upphetsningsnivå med hjälp av mätning med betygsskalor. För att testa om sambandet mellan säkerhetsfrågor/biverkningar och upphetsningsnivå skiljer sig mellan IBRF ACP/MCP vs. Standard of Care-grupper, med hjälp av mätning med betygsskalor, kommer två analyser att utföras. Kanonisk korrelation kommer att användas för att bestämma vilken biverkning (eller kombination av biverkningar) som förklarar variansen i betygsskalans mätningar. Dessutom kommer klusteranalys att användas för att avgöra om biverkningar är liknande relaterade till upphetsningsnivåer och resultat för patienter i de tre behandlingsgrupperna.

      ÖVERVAKNINGSPROCEDURER/OKOMDELANDE HÄNDELSER / SÄKERHETSENDPOINTS Övervakning Övervakarna kommer att besöka centret under studien, förutom att upprätthålla frekvent telefonisk och skriftlig kommunikation.

      Följande riktlinjer uppfyller kraven som specificeras i 21 CFR §812.46 och tillhandahålls för att beskriva procedurerna för övervakning av de kliniska studierna. Om utredaren inte följer det undertecknade utredaravtalet, protokollet eller något annat villkor för studien (t.ex. ofullständiga dataformulär), har monitorn rätt att avsluta utredarens deltagande i studien.

      Förstudieövervakningsprocedurer

      Den utsedda (dvs. monitor) kommer att ansvara för att fastställa och dokumentera att varje utredare tydligt förstår och accepterar de ansvarsområden och skyldigheter som uppstår vid genomförandet av en klinisk studie. Monitorn säkerställer innan studiestart att utredaren:

      • Förstår kraven för en välkontrollerad studie;

      • Förstår arten av det kliniska protokollet

      • Förstår hans/hennes rapporteringsskyldigheter;

      • Förstår kraven för enhetsansvar;

      • Förstår och accepterar skyldigheterna att erhålla informerat samtycke i enlighet med 21 CFR Parts 50 och 56;

      • Förstår och accepterar skyldigheten att erhålla IRB-granskning och godkännande av den kliniska undersökningen innan den initieras och att säkerställa fortsatt granskning av studien av IRB i enlighet med 21 CFR Part 56, och att hålla sponsorn informerad om alla IRB-åtgärder beträffande studien;

      • Förstår och accepterar kraven avseende finansiell information om kliniska undersökningar, 21 CFR Part 54;
      • Har lämpliga faciliteter och tillgång till ett tillräckligt antal lämpliga ämnen för att genomföra utredningen;
      • Har den nödvändiga dokumentationen i register, inklusive IRB-godkännande och ett undertecknat utredaravtal.

      Periodiska övervakningsbesök • Övervakningsbesök kommer att genomföras i enlighet med FDA:s riktlinjer för övervakning av kliniska undersökningar - januari 1988.

      • Monitorn bör besöka varje plats regelbundet för att säkerställa följande:

      • Faciliteterna fortsätter att vara adekvata och acceptabla.

      • Protokollet följs korrekt.

      • IRB/IEC har godkänt eller underrättats om protokolländringar.

      • Noggranna, fullständiga och aktuella register upprätthålls och informationen registreras.

      • Exakta, fullständiga och aktuella biverkningsrapporter skickas in

      • Informerat samtycke har erhållits.

      • Orsaken till att en försöksperson drar sig ur studien har dokumenterats.

      • Rapporter skickas till IRB och sponsor.

      • Lämplig personal genomför studieaktiviteter.

      • Alla fallrapportformulär och annan dokumentation relaterad till studien kommer att granskas vid mottagandet och platsen kommer omedelbart att meddelas om eventuella brister.

      Övervakningsbesökens frekvens a) Övervakningsbesöken kommer att genomföras i enlighet med vanliga övervakningsförfaranden. Övervakningsbesök kommer att bestämmas på grundval av flera faktorer, inklusive: b) Studiens varaktighet; c) Antal utestående frågor från tidigare besök; d) Antal inskrivna ämnen; e) Antal utredare/platser; och, f) Studiens komplexitet.

      Studieavslutning Alla rutinmässiga övervakningsfunktioner måste utföras före studieavslutningsbesöket. Studieavslutningsbesöket kan kombineras med ett övervakningsbesök. Följande uppgifter ska utföras vid det senaste besöket av monitorn.

   1. Påminn utredaren om skyldigheten att bevara journalerna. b) Förbered slutlig övervakningsrapport för IEC.

   Rapporter om övervakningsbesök

   Övervakningsrapporter måste fyllas i för alla besök. Rapporterna måste innehålla följande information:

   a) Datum för besöket; b) Lista över personal på studieplatsen som är närvarande; c) En sammanfattning av resultaten, problem