Exoszómákkal dúsított vérlemezkében gazdag plazma (PRP) lemezen belüli injekciója krónikus derékfájás esetén

A krónikus deréktáji fájdalom (LBP) kezelése hozzájárult annak magas társadalmi-gazdasági állapotához. A rendelkezésre álló kezelési lehetőségek nem javítják a degeneratív alapállapotot, bár megszüntetik annak tüneteit. Ez azt jelzi, hogy új terápiákra és/vagy beavatkozásokra van szükség, amelyek ténylegesen kezelik a diszkogén fájdalom kiváltó okait. A PRP közvetlen injektálásával az annulus fibrosusba és nucleus pulposusba történő biológiai terápia hatékony és megvalósítható lehetőségnek tűnik.

A vérből származó exoszómák potenciálisan átadhatják az egyedi őssejt-tulajdonságokat más őssejteknek, megkönnyítve az őssejt fenntartását, differenciálódását, önmegújulását és helyreállítását.

Javasoljuk, hogy végezzünk kontrollált, randomizált, kettős vak klinikai vizsgálatot az exoszómák biztonságosságának és hatékonyságának összehasonlítására LBP-ben. A vizsgálatban való részvétel előtt minden alanytól tájékozott beleegyezést kell kérni.

PRP készítés:

A vérmintát (60 ml) 600 x g-vel centrifugáljuk 10 percig, hogy összegyűjtsük a plazmafrakciót. És centrifugáltuk 4000 × g-vel 15 percig. Ezután a felülúszó vérlemezke-szegény plazmát (PPP) eltávolítják, így 1 ml PRP marad. A PPP-t egy mikronos speciális bennszülött tervezésű flush back szűrőn (Alpha Corpuscle, Delhi, India) vezetik át, így a PPP-frakcióban jelenlévő összes vérlemezke beszorul a szűrőbe. Ezeket a beszorult vérlemezkéket 1 ml PPP-vel visszaöblítik, hogy a vérlemezkék többségét visszanyerjék. Ezt összekeverik, majd egy WBC-szűrőn (Terumo Imuguard, USA) engedik át a leukociták kiszűrésére. A végső PRP koncentrátumot (0,1 ml) elemzik a teljes leukocita- és vérlemezkeszámra. Öt mintát véletlenszerűen választanak ki, amelyeket 10%-os kalcium-kloridban feloldott szarvasmarha-trombinnal kezelnek, és ELISA-val meghatározzák a növekedési faktorokat [thrombocyta eredetű növekedési faktorok (PDGF) és vascularis endothelialis növekedési faktorok (VEGF)].

A PRP mintánkban átlagosan 100 milliárd vérlemezke és 30-szor koncentrátum vérlemezke lesz 2 ml végső PRP-ben.

Exoszómák előkészítése:

Hatvan ml vért EDTA-val bevont csövekben 1200 g-val forgatnak 10 percig 4 °C-on a plazma elválasztása érdekében. A plazmát (0,22 μm) szűrővel szűrjük. A plazma átvitele közben kerülje a pelletált anyagot. Dobja el a pelletált anyagot. Ez a cső speciális szűrővel rendelkezik az exoszómák és más növekedést serkentő fehérjék koncentrálására. A csövet 3000 g-vel, szobahőmérsékleten, 30 percig centrifugáljuk, az exoszómákat összegyűjtjük, majd betöményítjük (0,5 ml-ről 3 ml-re). A szűrő falában eltömődött exoszómák helyreállításához adjunk hozzá 20 ml NS-t (lehetőleg PBS-t) a mikrocentrifuga csőbe, és öblítsük le centrifugálással 3500 g-vel. Gyűjtsük össze ismét a szűrőfalban eltömődött exoszómák koncentrált levest.

A fehérjetartalom mennyiségi meghatározását bicinkoninsav (BCA) vizsgálattal kell elvégezni.

Nanorészecske-követő analízis (NTA) Az 1×107/ml és 1×109/ml közötti koncentrációjú vesiculus szuszpenziókat 405 nm-es lézerrel felszerelt Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., Egyesült Királyság) segítségével vizsgáljuk meg a részecskék méretének és mennyiségének meghatározására. izolált. 60 mp-es videó készül 30 képkocka/sec sebességgel, és a részecskék mozgását az NTA szoftverrel (2.3-as verzió; NanoSight Ltd.) elemzik.

Western blot analízis Az exoszóma felülúszót mintapufferben denaturáljuk, és Western blot analízisnek vetjük alá. A tisztított exoszómákat a HSP70, a flottilin, a CD63, a TSG101 és a calnexin fehérjeexpressziójára elemezzük. A fehérjéket Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager rendszeren (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA) tettük láthatóvá.

A vizsgálati terv A betegeket véletlenszerűen 2 karba osztják, amelyek közül vagy a nucleus pulposus közepén exoszómákkal rendelkező PRP-t kapnak, vagy azonos mennyiségű placebót, és 2 gerinc- és orvosorvos fogja értékelni őket.

Randomizálás és a vizsgálat ágai:

Körülbelül háromszáz beteget szűrnek ki, hogy véletlenszerűen, 1:1 arányban osszák be a kezelési vagy kontrollcsoportokba, hogy 30 beteget jelöljenek be minden 4 karba:

1. Az I. kar placebót kap (triggerpont injekció a C kar alatt)

2. II. kar: a nucleus pulposus közepén lévő exoszómákkal rendelkező PRP-t kapni (2 ml) Teszttermék(ek), dózis és beadási mód a kezelés időtartama A számítógép által generált szám alapján véletlenszerűen választják ki a betegeket, akik egy megkülönböztethetetlen PRP injekciót kapnak. vagy placebót. A hát bőrfertőtlenítését követően a teljes beszerzett PRPex-ből 2 ml-t a lehető leghamarabb injektáltunk fluoroszkópia által irányított oldalirányú megközelítéssel. A betegek hasonló módon kapták a placebót, de nem dobták ki a triggerpont körüli izmok zónájában lesz. A vizsgálatot értékelő orvos és a beteg nem ismert a kezelésről. A betegeknek azt tanácsolták, hogy folytassák a szokásos gyakorlatokat, rutinszerű óvintézkedéseket, fizioterápiát és hátápolást.

   A paracetamol (maximum egy grammig) naponta háromszor használható mentőszerként. A vizsgálat során szisztémás kortikoszteroid, potenciális tünetmódosító gyógyszer/eljárás nem megengedett.

   Tanulmányértékelések / Eredménymérők

   1. Vizuális analóg skála (VAS)
   2. Roland Morris fogyatékossági kérdőív (RDQ)
   3. SF 36 egészségügyi kérdőív
   4. Funkcionális minősítési index

   5. MRI – porckorong degeneráció besorolása, T2 kvantifikálása a discitis bármely bizonyítéka A betegeket vizuális analóg skála (VAS), SF 36 egészségi kérdőív, funkcionális értékelési index alapján értékelik a kiinduláskor, majd 1, 3, 6 és 12 hónap múlva követik. A szerkezeti hatékonyságot MRI t2 kvantifikációval és osztályozással értékelik, amint azt az irodalomban korábban leírták a kiinduláskor és 6 hónap múlva, két tapasztalt radiológus által. Az értékelők megvakulnak.

      Az ellenőrző látogatásokat a szabványos ellenőrzési eljárások szerint végzik.

      A kezelés konkrét okból történő abbahagyását meg kell állapítani. A fertőzésre/diszcitiszre utaló minden jelet gondosan figyelni kell. A fájdalom súlyosbodását alaposan elemzik.

      A betegeket az első hónapban hetente egyszer, majd 6 hónapig havonta egyszer értékelik az esetleges káros hatások és életjelek szempontjából. Vérmintákat vettek a vizsgálatba való belépéskor, hat hónapos korban, valamint egy utolsó látogatás alkalmával, hogy megvizsgálják a biológiai változókat, valamint a máj- és vesefunkciókat. Felmérték a tolerálhatóságot, és laboratóriumi alapú hematológiai és biokémiai vizsgálatokat végeztek. A kezelési ággal fennálló lehetséges ok-okozati összefüggést is értékelni fogják.

      STATISZTIKAI ANALÍZIS:

      Varianciaanalízist (ANOVA) használunk a csoportok közötti különbségek vizsgálatára. A páros minták közötti különbségeket a kétirányú Student-féle t-próba segítségével hasonlítjuk össze. A változók közötti összefüggéseket Pearson-féle korrelációval értékeljük. Az SPSS 20.0-t fogják használni a statisztikai elemzésekhez (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekinthető.

      A biztonsági kérdések/mellékhatások és az arousal szint közötti kapcsolat azonosítása értékelési skálák segítségével. Annak tesztelésére, hogy a biztonsági problémák/mellékhatások és az izgalom szintje közötti kapcsolat eltér-e az IBRF ACP/MCP és a Standard of Care csoportok között, értékelési skálák segítségével, két elemzést végeznek. Kanonikus korrelációt használunk annak meghatározására, hogy melyik mellékhatás (vagy mellékhatások kombinációja) magyarázza az értékelési skála méréseinek eltéréseit. Ezenkívül klaszteranalízist alkalmaznak annak meghatározására, hogy a mellékhatások hasonló kapcsolatban állnak-e az izgalom szintjével és kimenetelével a három kezelési csoportban.

      MONITOROZÁSI ELJÁRÁSOK/KEDVEZMÉNYES ESEMÉNYEK/BIZTONSÁGI VÉGPONTOK Felügyelet A megfigyelők a gyakori telefonos és írásbeli kommunikáción túlmenően felkeresik a központot a vizsgálat ideje alatt.

      A következő iránymutatások megfelelnek a 21 CFR §812.46-ban meghatározott követelményeknek, és a klinikai vizsgálatok ellenőrzésére vonatkozó eljárások leírására szolgálnak. Ha a vizsgáló nem tartja be az aláírt Vizsgálói Megállapodást, a jegyzőkönyvet vagy a vizsgálat bármely feltételét (pl. hiányos adatlapok), a monitornak joga van megszakítani a vizsgáló részvételét a vizsgálatban.

      Tanulmány előtti megfigyelési eljárások

      A kijelölés (pl. monitor) lesz felelős annak megállapításáért és dokumentálásáért, hogy minden vizsgáló egyértelműen megérti és elfogadja a klinikai vizsgálat elvégzésével kapcsolatos felelősséget és kötelezettségeket. A monitor a vizsgálat megkezdése előtt biztosítja, hogy a vizsgáló:

      • Megérti a jól kontrollált vizsgálat követelményeit;

      • Megérti a klinikai protokoll természetét

      • Megérti jelentéstételi kötelezettségét;

      • Megérti az eszközelszámoltathatóság követelményeit;

      • Megérti és elfogadja a tájékozott beleegyezés megszerzésére vonatkozó kötelezettségeket a 21 CFR 50. és 56. részével összhangban;

      • Megérti és elfogadja azt a kötelezettséget, hogy a klinikai vizsgálat megkezdése előtt be kell szereznie az IRB felülvizsgálatát és jóváhagyását, valamint biztosítania kell a vizsgálat IRB általi folyamatos felülvizsgálatát a 21 CFR 56. részével összhangban, és tájékoztatnia kell a megbízót az összes IRB-vel kapcsolatos intézkedésről. a tanulmány;

      • Megérti és elfogadja a klinikai vizsgálatok pénzügyi közzétételére vonatkozó követelményeket, 21 CFR Part 54;
      • megfelelő létesítményekkel és megfelelő számú alkalmas alanyhoz való hozzáféréssel rendelkezik a vizsgálat lefolytatásához;
      • Rendelkezik a szükséges dokumentációval, beleértve az IRB jóváhagyását és az aláírt nyomozói szerződést.

      Időszakos ellenőrző látogatások • A megfigyelő látogatásokat az FDA klinikai vizsgálatok monitorozására vonatkozó iránymutatása (1988. január) szerint hajtják végre.

      • A monitornak rendszeresen meg kell látogatnia az egyes helyszíneket, hogy biztosítsa a következőket:

      • A létesítmények továbbra is megfelelőek és elfogadhatók.

      • A protokollt megfelelően követi.

      • Az IRB/IEC jóváhagyta vagy értesítette a protokoll bármilyen változását.

      • Pontos, teljes és aktuális nyilvántartást vezetünk, és az információkat rögzítjük.

      • Pontos, teljes és időben benyújtott nemkívánatos eseményekről szóló jelentések készülnek

      • Tájékozott hozzájárulást szereztek.

      • Az alany vizsgálatból való kilépésének okát dokumentálták.

      • A jelentéseket benyújtják az IRB-nek és a szponzornak.

      • A megfelelő személyzet tanulmányi tevékenységet végez.

      • A vizsgálattal kapcsolatos összes esetjelentési nyomtatványt és egyéb dokumentációt a kézhezvételkor átnézzük, és az esetleges hiányosságokról haladéktalanul értesítjük a helyszínt.

      A monitoring látogatások gyakorisága a) A monitoring látogatásokat a szabványos megfigyelési eljárások szerint végzik. A megfigyelő látogatásokat számos tényező alapján határozzák meg, többek között: b) a vizsgálat időtartama; c) A korábbi látogatások során fennálló problémák száma; d) A beiratkozott tantárgyak száma; e) A nyomozók/telephelyek száma; és f) a vizsgálat összetettsége.

      A vizsgálat befejezése Minden rutin monitorozási funkciót el kell végezni a vizsgálat befejező látogatása előtt. A vizsgálat befejező látogatása összevonható megfigyelő látogatással. A következő feladatokat kell elvégezni a monitor utolsó látogatásakor.

   1. Emlékeztesd a nyomozót az iratok megőrzésének kötelezettségére. b) Végső monitoring jelentést készíteni az IEC számára.

   Jelentések a megfigyelő látogatásokról

   A megfigyelési jelentést minden látogatásról ki kell tölteni. A jelentéseknek a következő információkat kell tartalmazniuk:

   a) a látogatás időpontja; b) A jelenlévő tanulmányi helyszín személyzetének listája; c) A megállapítások, problémák összefoglalása