Intra-discale injectie van bloedplaatjesrijk plasma (PRP) verrijkt met exosomen bij chronische lage-rugpijn

De behandeling van chronische lage-rugpijn (LBP) heeft bijgedragen aan de hoge sociaaleconomische status ervan. De tussenwervelschijf is verantwoordelijk voor 40% of meer gevallen van chronische LRP. Beschikbare behandelingsopties verbeteren de onderliggende degeneratieve aandoening niet, hoewel ze wel de symptomen ervan oplossen. Dit geeft aan dat er behoefte is aan nieuwe therapieën en/of interventies die de onderliggende oorzaken van discogene pijn daadwerkelijk behandelen. Biologische therapieën door directe injectie van PRP in de annulus fibrosus en nucleus pulposus lijken een effectieve en haalbare optie.

Exosomen die zijn afgeleid van bloed, kunnen mogelijk enkele van de unieke stamceleigenschappen doorgeven aan andere stamcellen, waardoor het behoud, de differentiatie, zelfvernieuwing en reparatie van stamcellen worden vergemakkelijkt.

We stellen voor om een ​​gecontroleerde, gerandomiseerde, dubbelblinde klinische studie uit te voeren om de veiligheid en werkzaamheid van exosomen bij lage rugpijn te vergelijken. Geïnformeerde toestemming zal worden verkregen van alle proefpersonen voorafgaand aan deelname aan de studie.

PRP-voorbereiding:

Bloedmonster (60 ml) wordt gedurende 10 minuten bij 600 x g gecentrifugeerd om de plasmafractie te verzamelen. En gecentrifugeerd bij 4000×g gedurende 15 min. Supernatant plaatjesarm plasma (PPP) wordt vervolgens verwijderd, waarbij 1 ml PRP overblijft. PPP zal door een speciaal inheems ontworpen terugspoelfilter van één micron worden geleid (Alpha Corpuscle, Delhi, India), zodat alle bloedplaatjes die aanwezig zijn in de PPP-fractie in het filter terechtkomen. Deze ingesloten bloedplaatjes worden teruggespoeld met 1 ml PPP om de meeste bloedplaatjes te verwijderen. Dit wordt met elkaar gemengd en vervolgens door een WBC-filter (Terumo Imuguard, VS) geleid om de leukocyten eruit te filteren. Het uiteindelijke PRP-concentraat (0,1 ml) wordt geanalyseerd op het totale aantal leukocyten en bloedplaatjes. Vijf monsters zullen willekeurig worden geselecteerd, behandeld met rundertrombine gereconstitueerd in 10% calciumchloride en zullen worden beoordeeld op groeifactoren [van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren (PDGF) en vasculaire endotheliale groeifactoren (VEGF)] door middel van ELISA.

Gemiddeld bevat ons PRP-monster 100 miljard bloedplaatjes en 30x concentraat van bloedplaatjes in 2 ml uiteindelijke PRP.

Exosomen voorbereiding:

Zestig ml bloed in met EDTA gecoate buisjes wordt gedurende 10 minuten bij 4°C bij 1.200 g gecentrifugeerd om plasma te scheiden. Plasma wordt gefilterd met (0,22 μm) filter. Vermijd elk gepelleteerd materiaal tijdens het overbrengen van het plasma. Gooi het gepelleteerde materiaal weg. Deze buis heeft een speciaal filter om exosomen en andere groeibevorderende eiwitten te concentreren. De buis wordt gecentrifugeerd bij 3000 g, KT, 30 min en exosomen worden verzameld en vervolgens geconcentreerd (0,5 ml tot 3 ml). Om exosomen die in de wand van het filter zijn verstopt te herstellen, voegt u 20 ml NS (bij voorkeur PBS) toe aan een microcentrifugebuis en spoelt u het door centrifugeren bij 3500 g. Verzamel opnieuw de geconcentreerde soep van exosomen die in de filterwand verstopt zaten.

Kwantificering van het eiwitgehalte zal gebeuren door middel van een bicinchoninezuur (BCA)-assay.

Nanoparticle tracking analysis (NTA) Vesikelsuspensies met concentraties tussen 1×107/ml en 1×109/ml zullen worden onderzocht met behulp van een Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., UK) uitgerust met een 405 nm laser om de grootte en hoeveelheid deeltjes te bepalen geïsoleerd. Er wordt een video van 60 seconden gemaakt met een framesnelheid van 30 frames/sec, en de beweging van deeltjes wordt geanalyseerd met behulp van NTA-software (versie 2.3; NanoSight Ltd.).

Western-blotanalyse Het exosoomsupernatans wordt gedenatureerd in monsterbuffer en wordt onderworpen aan Western-blotanalyse. Gezuiverde exosomen zullen geanalyseerd worden op eiwitexpressie HSP70, flottilin, CD63, TSG101 en calnexin. De eiwitten werden gevisualiseerd op het Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager-systeem (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, VS).

Onderzoeksopzet Patiënten worden gerandomiseerd in 2 armen met hetzij PRP met exosomen in het centrum van de nucleus pulposus of een gelijke hoeveelheid placebo en zullen worden beoordeeld door 2 interventiegeneeskundigen en geneeskundigen.

Randomisatie en armen van het onderzoek:

Ongeveer driehonderd patiënten zullen worden gescreend om willekeurig te worden toegewezen aan behandelings- of controlegroepen in een verhouding van 1:1, om 30 patiënten toe te wijzen aan elke 4 armen:

1. Arm I zal worden toegewezen aan placebo (triggerpuntinjectie onder C-arm)

2. Arm II: voor het ontvangen van PRP met exosomen in het midden van de nucleus pulposus (2 ml) Testproduct(en), dosis en wijze van toediening duur van de behandeling Patiënten worden willekeurig geselecteerd op basis van een door de computer gegenereerd nummer om één niet te onderscheiden injectie met PRP ex te krijgen of placebo. Na huiddesinfectie van de rug werd 2 ml van de totale verkregen PRPex zo snel mogelijk geïnjecteerd door middel van een door fluoroscopie geleide laterale benadering. Patiënten kregen de placebo op een vergelijkbare manier, maar niet om .it te diskwalificeren zal zich in de spierzone rond het triggerpoint bevinden. De arts die het onderzoek evalueerde en de patiënt waren onbekend met de behandeling. Patiënten werd geadviseerd om door te gaan met de gebruikelijke oefeningen, routinematige voorzorgsmaatregelen, fysiotherapie en rugzorg.

   Paracetamol (tot maximaal één gram) driemaal daags mag als noodmedicijn worden gebruikt. Tijdens het onderzoek zijn geen systemische corticosteroïden, mogelijke symptoommodificerende geneesmiddelen/procedures toegestaan.

   Studiebeoordelingen / Uitkomstmaten

   1. Visuele analoge schaal (VAS)
   2. Roland Morris Invaliditeitsvragenlijst (RDQ)
   3. SF 36 gezondheidsvragenlijst
   4. Functionele beoordelingsindex

   5. MRI - gradatie van discusdegeneratie, T2-kwantificering elk bewijs van discitis Patiënten worden beoordeeld met behulp van een visuele analoge schaal (VAS), SF 36-gezondheidsvragenlijst, functionele beoordelingsindex bij aanvang en gevolgd na 1, 3, 6 en 12 maanden. De structurele werkzaamheid zal door twee ervaren radiologen worden beoordeeld door middel van MRI t2-kwantificering en -classificatie, zoals eerder beschreven in de literatuur bij baseline en na 6 maanden. Beoordelaars worden verblind.

      Monitoringbezoeken zullen worden uitgevoerd volgens standaard monitoringprocedures.

      Beëindiging van de behandeling met een specifieke reden zal worden vastgesteld. Elk bewijs van infectie/discitis zal zorgvuldig worden geobserveerd. Verergering van pijn zal grondig worden geanalyseerd.

      De patiënten worden gedurende de eerste maand één keer per week en daarna één keer per maand tot 6 maanden geëvalueerd op eventuele bijwerkingen en vitale functies. Bloedmonsters werden verzameld op het moment van binnenkomst in het onderzoek, na zes maanden, en bij een laatste bezoek om biologische variabelen en lever- en nierfuncties te onderzoeken. De verdraagbaarheid werd beoordeeld en op laboratorium gebaseerde hematologische en biochemische tests werden uitgevoerd. Ook wordt gekeken naar een mogelijk causaal verband met de behandelarm.

      STATISTISCHE ANALYSE:

      Variantieanalyse (ANOVA) zal worden gebruikt om de verschillen tussen groepen te onderzoeken. Verschillen in gepaarde steekproeven worden vergeleken met behulp van de tweezijdige Student's t-toets. Correlaties tussen variabelen zullen worden beoordeeld door Pearson's correlatie. SPSS 20.0 zal worden gebruikt voor statistische analyses (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

      Identificatie van de relatie tussen veiligheidskwesties/bijwerkingen en opwindingsniveau met behulp van meting door beoordelingsschalen. Om te testen of de relatie tussen veiligheidskwesties/bijwerkingen en opwindingsniveau verschilt tussen IBRF ACP/MCP vs. Standard of Care-groepen, met behulp van meting door beoordelingsschalen, zullen twee analyses worden uitgevoerd. Canonieke correlatie zal worden gebruikt om te bepalen welke bijwerking (of combinatie van bijwerkingen) de variantie in de metingen van de beoordelingsschaal verklaart. Daarnaast zal clusteranalyse worden gebruikt om te bepalen of bijwerkingen vergelijkbaar zijn met opwindingsniveaus en uitkomsten voor patiënten in de drie behandelingsgroepen.

      MONITORING PROCEDURES/BIJWERKINGEN / VEILIGHEID EINDPUNTEN Monitoring De monitoren zullen het centrum bezoeken tijdens het onderzoek naast het onderhouden van frequente telefonische en schriftelijke communicatie.

      De volgende richtlijnen voldoen aan de vereisten gespecificeerd in 21 CFR §812.46 en zijn bedoeld om de procedures voor het monitoren van de klinische onderzoeken te beschrijven. Als de onderzoeker zich niet houdt aan de ondertekende Onderzoekersovereenkomst, het protocol of enige voorwaarde van het onderzoek (bijv. onvolledige gegevensformulieren), heeft de monitor het recht om de deelname van de onderzoeker aan het onderzoek te beëindigen.

      Procedures voor monitoring voorafgaand aan de studie

      De aangewezen (d.w.z. monitor) zal verantwoordelijk zijn voor het vaststellen en documenteren dat elke onderzoeker de verantwoordelijkheden en verplichtingen bij het uitvoeren van een klinisch onderzoek duidelijk begrijpt en aanvaardt. De monitor zorgt er voorafgaand aan de start van het onderzoek voor dat de onderzoeker:

      • Begrijpt de vereisten voor een goed gecontroleerd onderzoek;

      • Begrijpt de aard van het klinische protocol

      • Begrijpt zijn/haar rapportageverplichtingen;

      • Begrijpt de vereisten voor apparaatverantwoording;

      • Begrijpt en aanvaardt de verplichtingen om geïnformeerde toestemming te verkrijgen in overeenstemming met 21 CFR delen 50 en 56;

      • Begrijpt en aanvaardt de verplichting om IRB-beoordeling en goedkeuring van het klinisch onderzoek te verkrijgen voordat het wordt gestart en om te zorgen voor voortdurende beoordeling van het onderzoek door de IRB in overeenstemming met 21 CFR Part 56, en om de sponsor op de hoogte te houden van alle IRB-acties met betrekking tot de studie;

      • Begrijpt en accepteert de vereisten met betrekking tot financiële openbaarmaking van klinische onderzoeken, 21 CFR Part 54;
      • Heeft adequate faciliteiten en toegang tot een voldoende aantal geschikte proefpersonen om het onderzoek uit te voeren;
      • Heeft de vereiste documentatie in het dossier, inclusief IRB-goedkeuring en een ondertekende onderzoekersovereenkomst.

      Periodieke controlebezoeken • Controlebezoeken zullen worden uitgevoerd in overeenstemming met de FDA-richtlijn voor de controle van klinische onderzoeken - januari 1988.

      • De monitor moet elke locatie regelmatig bezoeken om het volgende te waarborgen:

      • Voorzieningen blijven adequaat en acceptabel.

      • Het protocol wordt goed gevolgd.

      • De IRB/IEC heeft eventuele protocolwijzigingen goedgekeurd of op de hoogte gebracht.

      • Nauwkeurige, volledige en actuele gegevens worden bijgehouden en de informatie wordt vastgelegd.

      • Nauwkeurige, volledige en tijdige meldingen van ongewenste voorvallen worden ingediend

      • Geïnformeerde toestemming is verkregen.

      • De reden voor de terugtrekking van een proefpersoon uit het onderzoek is gedocumenteerd.

      • Rapportages worden ingediend bij de IRB en sponsor.

      • Het juiste personeel voert studiewerkzaamheden uit.

      • Alle casusrapportformulieren en andere documentatie met betrekking tot het onderzoek zullen na ontvangst worden beoordeeld en de site zal onmiddellijk op de hoogte worden gebracht van eventuele tekortkomingen.

      Frequentie van monitoringbezoeken a) Monitoringbezoeken zullen worden uitgevoerd volgens standaard monitoringprocedures. Controlebezoeken zullen worden bepaald op basis van verschillende factoren, waaronder: b) duur van het onderzoek; c) aantal openstaande kwesties van eerdere bezoeken; d) Aantal ingeschreven proefpersonen; e) Aantal onderzoekers/locaties; en f) Complexiteit van het onderzoek.

      Beëindiging van de studie Alle routinecontrolefuncties moeten worden uitgevoerd voorafgaand aan het bezoek aan de studiebeëindiging. Het studiebeëindigingsbezoek kan worden gecombineerd met een controlebezoek. De volgende taken moeten bij het laatste bezoek van de monitor worden uitgevoerd.

   1. Herinner de onderzoeker aan de bewaarplicht. b) Opstellen van het definitieve monitoringrapport voor IEC.

   Verslagen van controlebezoeken

   Voor alle bezoeken moeten monitoringrapporten worden ingevuld. Rapporten moeten de volgende informatie bevatten:

   a) Datum van het bezoek; b) Lijst van aanwezig personeel op de studielocatie; c) Een samenvatting van de bevindingen, problemen