Injeção intradiscal de plasma rico em plaquetas (PRP) enriquecido com exossomos na dor lombar crônica

O manejo da dor lombar crônica (LBP) contribuiu para sua alta socioeconômica. O disco intervertebral é responsável por 40% ou mais dos casos de lombalgia crônica. As opções de tratamento disponíveis não melhoram a condição degenerativa subjacente, embora resolvam seus sintomas. Isso indica a necessidade de novas terapias e/ou intervenções que realmente tratem as causas subjacentes da dor discogênica. Terapias biológicas por injeção direta de PRP no anel fibroso e núcleo pulposo parecem uma opção efetiva e viável.

Os exossomos derivados do sangue podem potencialmente transmitir algumas das propriedades únicas das células-tronco para outras células-tronco, facilitando a manutenção, diferenciação, auto-renovação e reparo do tronco.

Propomos um ensaio clínico controlado, randomizado e duplo-cego para comparar a segurança e a eficácia dos exossomos na lombalgia. O consentimento informado será obtido de todos os indivíduos antes da participação no estudo.

Preparação do PRP:

A amostra de sangue (60 ml) será centrifugada a 600×g por 10 min para coleta da fração plasmática. E centrifugado a 4000 × g por 15 min. O plasma pobre em plaquetas (PPP) sobrenadante será então removido, deixando 1 ml de PRP. O PPP será passado através de um filtro de retorno de descarga especial de um mícron projetado na Índia (Alpha Corpuscle, Delhi, Índia) para que todas as plaquetas presentes na fração de PPP fiquem presas no filtro. Essas plaquetas presas serão lavadas de volta com 1 ml de PPP para recuperar a maioria das plaquetas. Isso será misturado e depois passado por um filtro WBC (Terumo Imuguard, EUA) para filtrar os leucócitos. O concentrado final de PRP (0,1 ml) será analisado quanto à contagem total de leucócitos e plaquetas. Cinco amostras serão selecionadas aleatoriamente tratadas com trombina bovina reconstituída em cloreto de cálcio a 10% e serão avaliadas quanto aos fatores de crescimento [fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF)] por ELISA.

Em média, nossa amostra de PRP terá 100 bilhões de plaquetas e 30x concentrado de plaquetas sanguíneas em 2ml de PRP final.

Preparação de exossomos:

Sessenta ml de sangue em tubos revestidos com EDTA serão centrifugados a 1.200 g por 10 minutos a 4°C para separar o plasma. O plasma será filtrado com filtro (0,22 μm). Evite qualquer material granulado durante a transferência do plasma. Descarte o material peletizado. Este tubo possui filtro especial para concentrar exossomos e outras proteínas promotoras de crescimento. O tubo será centrifugado a 3000 g, RT, 30 min e os exossomos serão coletados e então concentrados (0,5 ml a 3 ml). Para recuperar os exossomos obstruídos na parede do filtro, adicione 20 ml de NS (de preferência PBS) no tubo da microcentrífuga e enxágue por centrifugação a 3.500 g. Recolha a sopa concentrada de exossomos novamente que estavam entupidos na parede do filtro.

A quantificação do teor de proteína será feita pelo ensaio de ácido bicinconínico (BCA).

Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) Suspensões de vesículas com concentrações entre 1×107/ml e 1×109/ml serão examinadas usando um Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., Reino Unido) equipado com um laser de 405 nm para determinar o tamanho e a quantidade de partículas isolado. Um vídeo de 60 segundos de duração será feito com uma taxa de quadros de 30 quadros/s e o movimento das partículas será analisado usando o software NTA (versão 2.3; NanoSight Ltd.).

Análise de Western blot O sobrenadante do exossomo será desnaturado em tampão de amostra e será submetido à análise de western blot. Exossomos purificados serão analisados ​​quanto à expressão das proteínas HSP70, flottilina, CD63, TSG101 e calnexina. As proteínas foram visualizadas no sistema Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, EUA).

Desenho do estudo Os pacientes serão randomizados em 2 braços para receber PRP com exossomos no centro do núcleo pulposo ou quantidade igual de placebo e serão avaliados por 2 médicos intervencionistas de coluna e medicina.

Randomização e Braços do estudo:

Aproximadamente trezentos pacientes serão selecionados para alocar aleatoriamente em grupos de tratamento ou controle em uma proporção de 1:1, para atribuir 30 pacientes em cada 4 braços:

1. O braço I será designado para receber placebo (injeção do ponto de gatilho sob o braço C)

2. Braço II: para receber PRP com exossomos no centro do núcleo pulposo (2ml) Produto(s) de teste, dose e modo de administração duração do tratamento Os pacientes serão selecionados aleatoriamente com base no número gerado por computador para receber uma injeção indistinguível de PRP ex ou placebo. Após a desinfecção da pele das costas, 2 ml do PRPex total adquirido foram injetados o mais rápido possível por uma abordagem lateral guiada por fluoroscopia. Os pacientes receberam o placebo de maneira semelhante, mas não para discar. estará na zona dos músculos ao redor do ponto gatilho. O médico que avaliou o estudo e o paciente desconheciam o tratamento. Os pacientes foram aconselhados a continuar com os exercícios habituais, precauções de rotina, fisioterapia e cuidados com as costas.

   O paracetamol (no máximo até um grama) três vezes ao dia, poderá ser usado como medicamento de resgate. Nenhum corticosteróide sistêmico, medicamento/procedimento potencialmente modificador de sintomas será permitido durante o estudo.

   Avaliações do estudo / Medidas de resultados

   1. Escala visual analógica (VAS)
   2. Questionário de Incapacidade Roland Morris (RDQ)
   3. Questionário de saúde SF 36
   4. Índice de classificação funcional

   5. RM - graduação da degeneração do disco, quantificação T2 qualquer evidência de discite Os pacientes serão avaliados pela escala analógica visual (VAS), questionário de saúde SF 36, índice de classificação funcional na linha de base e acompanhados em 1, 3, 6 e 12 meses. A eficácia estrutural será avaliada por quantificação e graduação de t2 por ressonância magnética, conforme descrito anteriormente na literatura no início do estudo e aos 6 meses por dois radiologistas experientes. Os avaliadores serão cegos.

      As visitas de monitoramento serão conduzidas de acordo com os procedimentos de monitoramento padrão.

      A descontinuação do tratamento por um motivo específico será verificada. Qualquer evidência de infecção/discite será cuidadosamente observada. O agravamento da dor será profundamente analisado.

      Os pacientes serão avaliados quanto a quaisquer efeitos adversos e sinais vitais uma vez por semana durante o primeiro mês e depois uma vez por mês até 6 meses. Amostras de sangue foram coletadas no momento da entrada no estudo, aos seis meses, e em uma visita final para examinar variáveis ​​biológicas, bem como funções hepáticas e renais. A tolerabilidade foi avaliada e ensaios hematológicos e bioquímicos baseados em laboratório foram realizados. Uma possível relação causal com o braço de tratamento também será avaliada.

      ANÁLISE ESTATÍSTICA:

      A análise de variância (ANOVA) será utilizada para investigar as diferenças entre os grupos. Diferenças em amostras pareadas serão comparadas usando o teste t de Student bicaudal. As correlações entre as variáveis ​​serão avaliadas pela correlação de Pearson. SPSS 20.0 será usado para análises estatísticas (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). P<0,05 será considerado estatisticamente significativo.

      Identificação da relação entre questões de segurança/efeitos colaterais e nível de excitação usando medição por escalas de classificação. Para testar se a relação entre questões de segurança/efeitos colaterais e nível de excitação difere entre os grupos IBRF ACP/MCP vs. Padrão de Cuidados, usando medição por escalas de classificação, duas análises serão conduzidas. A correlação canônica será usada para determinar qual efeito colateral (ou combinação de efeitos colaterais) explica a variação nas medições da escala de avaliação. Além disso, a análise de cluster será empregada para determinar se os efeitos colaterais estão relacionados de forma semelhante aos níveis de excitação e resultados para pacientes nos três grupos de tratamento.

      PROCEDIMENTOS DE MONITORAMENTO/EVENTOS ADVERSOS/DEFINIÇÕES DE SEGURANÇA Monitoramento Os monitores visitarão o centro durante o estudo, além de manter comunicação frequente por telefone e por escrito.

      As diretrizes a seguir atendem aos requisitos especificados em 21 CFR §812.46 e são fornecidas para descrever os procedimentos para monitorar os estudos clínicos. Se o investigador não estiver cumprindo o Acordo do Investigador assinado, o protocolo ou qualquer condição do estudo (por exemplo, formulários de dados incompletos), o monitor tem o direito de encerrar a participação do investigador no estudo.

      Procedimentos de monitoramento pré-estudo

      O designado (ou seja, monitor) será responsável por determinar e documentar que cada investigador entende e aceita claramente as responsabilidades e obrigações incorridas na condução de um estudo clínico. O monitor garantirá, antes do início do estudo, que o investigador:

      • Compreende os requisitos para um estudo bem controlado;

      • Compreende a natureza do protocolo clínico

      • Compreende suas obrigações de relatórios;

      • Compreende os requisitos de responsabilidade do dispositivo;

      • Compreende e aceita as obrigações de obter consentimento informado de acordo com 21 CFR Partes 50 e 56;

      • Compreende e aceita a obrigação de obter a revisão e aprovação do IRB da investigação clínica antes de ser iniciada e garantir a revisão contínua do estudo pelo IRB de acordo com 21 CFR Parte 56, e manter o patrocinador informado de todas as ações do IRB relacionadas o estudo;

      • Compreende e aceita os requisitos relativos à divulgação financeira de investigações clínicas, 21 CFR Parte 54;
      • Tem instalações adequadas e acesso a um número adequado de sujeitos adequados para conduzir a investigação;
      • Possui a documentação necessária em arquivo, incluindo a aprovação do IRB e um contrato de investigador assinado.

      Visitas de monitoramento periódicas • As visitas de monitoramento serão realizadas de acordo com a Diretriz da FDA para o monitoramento de investigações clínicas - janeiro de 1988.

      • O monitor deve visitar cada local regularmente para garantir o seguinte:

      • As instalações continuam adequadas e aceitáveis.

      • O protocolo está sendo seguido corretamente.

      • O IRB/IEC aprovou ou foi notificado sobre quaisquer alterações de protocolo.

      • Registros precisos, completos e atuais estão sendo mantidos e as informações registradas.

      • Relatórios de eventos adversos precisos, completos e oportunos estão sendo enviados

      • O consentimento informado foi obtido.

      • O motivo da retirada de um sujeito do estudo foi documentado.

      • Os relatórios estão sendo enviados ao IRB e ao patrocinador.

      • A equipe apropriada está realizando atividades de estudo.

      • Todos os formulários de relato de caso e outras documentações relacionadas ao estudo serão revisados ​​após o recebimento, e o centro será prontamente notificado sobre quaisquer deficiências.

      Frequência das Visitas de Monitoramento a) As visitas de monitoramento serão conduzidas de acordo com os procedimentos de monitoramento padrão. As visitas de acompanhamento serão determinadas com base em vários fatores, entre os quais: b) Duração do estudo; c) Número de questões pendentes de visitas anteriores; d) Número de disciplinas inscritas; e) Número de investigadores/locais; e, f) Complexidade do estudo.

      Término do estudo Todas as funções de monitoramento de rotina devem ser executadas antes da visita de término do estudo. A visita de término do estudo pode ser combinada com uma visita de monitoramento. As seguintes tarefas devem ser concluídas na última visita do monitor.

   1. Lembre o investigador da obrigação de manter os registros. b) Preparar relatório final de monitoramento para IEC.

   Relatórios de Visitas de Acompanhamento

   Os relatórios de monitoramento devem ser preenchidos para todas as visitas. Os relatórios devem incluir as seguintes informações:

   a) Data da visita; b) Lista do pessoal presente no local do estudo; c) Um resumo das descobertas, problemas