Intra-diskal injektion af blodpladerigt plasma (PRP) beriget med exosomer i kronisk lænderygsmerter

Håndtering af kroniske lændesmerter (LBP) har bidraget til dens høje socioøkonomiske. Den intervertebrale disk står for 40% eller flere tilfælde af kronisk LBP. Tilgængelige behandlingsmuligheder forbedrer ikke den underliggende degenerative tilstand, selvom de løser dens symptomer. Dette indikerer behovet for nye terapier og/eller interventioner, der faktisk behandler de underliggende årsager til diskogen smerte. Biologiske terapier ved direkte injektion af PRP i annulus fibrosus og nucleus pulposus synes at være en effektiv og gennemførlig mulighed.

Eksosomer afledt af blod kan potentielt overføre nogle af de unikke stamcelleegenskaber til andre stamceller, hvilket letter vedligeholdelse, differentiering, selvfornyelse og reparation.

Vi foreslår at have et kontrolleret, randomiseret, dobbeltblindt klinisk forsøg for at sammenligne sikkerheden og effektiviteten af ​​exosomer i LBP. Informeret samtykke vil blive indhentet fra alle forsøgspersoner inden studiedeltagelse.

PRP-forberedelse:

Blodprøve (60 ml) vil blive centrifugeret ved 600×g i 10 minutter for at opsamle plasmafraktion. Og centrifugeret ved 4000×g i 15 min. Supernatant blodpladefattigt plasma (PPP) vil derefter blive fjernet, hvilket efterlader 1 ml PRP. PPP vil blive ført gennem et-mikrons specielt indfødte designet flush back filter (Alpha Corpuscle, Delhi, Indien), så alle de blodplader, der er til stede i PPP-fraktionen, bliver fanget i filteret. Disse fangede blodplader vil blive skyllet tilbage med 1 ml PPP for at hente de fleste af blodpladerne. Dette vil blive blandet sammen og derefter ført gennem et WBC-filter (Terumo Imuguard, USA) for at filtrere leukocytterne fra. Det endelige PRP-koncentrat (0,1 ml) vil blive analyseret for totalt leukocyt- og blodpladetal. Fem prøver vil blive udvalgt tilfældigt behandlet med bovint thrombin rekonstitueret i 10% calciumchlorid vil blive vurderet for vækstfaktorer [blodpladeafledte vækstfaktorer (PDGF) og vaskulære endotelvækstfaktorer (VEGF)] ved ELISA.

I gennemsnit vil vores PRP-prøve have 100 milliarder blodplader og 30x koncentrat af blodplader i 2ml endelig PRP.

Eksosom forberedelse:

Tres ml blod i EDTA-coatede rør centrifugeres ved 1.200 g i 10 minutter ved 4°C for at adskille plasma. Plasma vil blive filtreret med (0,22 μm) filter. Undgå pelleteret materiale under overførsel af plasma. Kassér det pelleterede materiale. Dette rør har et specielt filter til at koncentrere exosomer og andre vækstfremmende proteiner. Røret vil blive centrifugeret ved 3000 g, RT, 30 minutter, og exosomer vil blive opsamlet og derefter koncentreret (0,5 ml til 3 ml). For at genvinde exosomer, der er tilstoppet i filtervæggen - tilsæt 20 ml NS (fortrinsvis PBS) i mikrocentrifugerøret og skyl det ved centrifugering ved 3.500 g. Saml den koncentrerede suppe af exosomer igen, som var tilstoppet i filtervæggen.

Kvantificering af proteinindhold vil blive udført ved bicinchoninsyre (BCA) assay.

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) Vesikelsuspensioner med koncentrationer mellem 1×107/ml og 1×109/ml vil blive undersøgt ved hjælp af en Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., UK) udstyret med en 405 nm laser for at bestemme størrelsen og mængden af ​​partikler isoleret. En video af 60 sekunders varighed vil blive optaget med en billedhastighed på 30 billeder/sek., og partikelbevægelse vil blive analyseret ved hjælp af NTA-software (version 2.3; NanoSight Ltd.).

Western blot-analyse Eksosom-supernatanten vil blive denatureret i prøvebuffer og vil blive udsat for western-blot-analyse. Oprensede exosomer vil blive analyseret for proteinekspression HSP70, flottilin, CD63, TSG101 og calnexin. Proteinerne blev visualiseret på Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager-systemet (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Studiedesign Patienter vil blive randomiseret i 2 arme med enten at modtage PRP med exosomer i midten af ​​nucleus pulposus eller lige stor mængde placebo og vil blive evalueret af 2 interventionelle rygsøjle- og medicinlæger.

Randomisering og våben af ​​undersøgelsen:

Cirka 300 patienter vil blive screenet for tilfældigt at allokere til behandlings- eller kontrolgrupper i forholdet 1:1 for at tildele 30 patienter i hver 4-arm:

1. Arm I vil blive tildelt placebo (triggerpunkt-injektion under C-armen)

2. Arm II: at modtage PRP med exosomer i midten af ​​nucleus pulposus (2ml) Testprodukt(er), dosis og indgivelsesmåde behandlingsvarighed Patienterne vil blive tilfældigt udvalgt baseret på computergenereret antal for at modtage én udskillelig injektion af PRP ex. eller placebo. Efter huddesinfektion af ryggen blev 2 ml af den samlede PRPex, der blev tilvejebragt, injiceret så hurtigt som muligt ved en fluoroskopi-styret lateral tilgang. Patienterne modtog placeboen på en lignende måde, men ikke til diskus vil være i muskelzonen omkring triggerpunktet. Lægen, der evaluerede undersøgelsen, og patienten var ukendt for behandling. Patienterne blev rådet til at fortsætte med sædvanlige øvelser, rutinemæssige forholdsregler, fysioterapi og rygpleje.

   Paracetamol (op til maks. et gram) tre gange dagligt vil få lov til at blive brugt som redningsmiddel. Ingen systemisk kortikosteroid, potentielt symptommodificerende lægemiddel/procedure vil være tilladt under undersøgelsen.

   Studievurderinger / Resultatmål

   1. Visuel analog skala (VAS)
   2. Roland Morris Disability Questionnaire (RDQ)
   3. SF 36 sundhedsspørgeskema
   4. Funktionelt ratingindeks

   5. MR - gradering af diskusdegeneration, T2-kvantificering enhver tegn på discitis Patienter vil blive vurderet ved hjælp af visuel analog skala (VAS), SF 36 sundhedsspørgeskema, funktionelt ratingindeks ved baseline og fulgt efter 1, 3, 6 og 12 måneder. Den strukturelle effektivitet vil evalueres ved MRI t2 kvantificering og gradering som beskrevet tidligere i litteraturen ved baseline og efter 6 måneder af to erfarne radiologer. Bedømmere vil blive blindet.

      Overvågningsbesøg vil blive gennemført i overensstemmelse med standardovervågningsprocedurer.

      Afbrydelse af behandlingen med en bestemt årsag vil blive konstateret. Ethvert tegn på infektion/diskitis vil blive nøje observeret. Forværring af smerte vil blive dybt analyseret.

      Patienterne vil blive evalueret for eventuelle bivirkninger og vitale tegn en gang om ugen i den første måned og derefter en gang om måneden i op til 6 måneder. Blodprøver blev indsamlet på tidspunktet for indtræden i undersøgelsen, efter seks måneder, og ved et sidste besøg for at undersøge biologiske variabler samt lever- og nyrefunktioner. Tolerabiliteten blev vurderet, og laboratoriebaserede hæmatologiske og biokemiske analyser blev udført. En eventuel årsagssammenhæng med behandlingsarmen vil også blive vurderet.

      STATISTISK ANALYSE:

      Variansanalyse (ANOVA) vil blive brugt til at undersøge forskellene mellem grupper. Forskelle i parrede prøver vil blive sammenlignet ved hjælp af den tosidede Students t-test. Korrelationer mellem variable vil blive vurderet ved Pearsons korrelation. SPSS 20.0 vil blive brugt til statistiske analyser (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 vil blive anset for at være statistisk signifikant.

      Identifikation af sammenhængen mellem sikkerhedsproblemer/bivirkninger og ophidselsesniveau ved hjælp af måling ved vurderingsskalaer. For at teste, om forholdet mellem sikkerhedsproblemer/bivirkninger og ophidselsesniveau adskiller sig mellem IBRF ACP/MCP vs. Standard of Care-grupper, vil der blive udført to analyser. Kanonisk korrelation vil blive brugt til at bestemme, hvilken bivirkning (eller kombination af bivirkninger) der forklarer variansen i vurderingsskalamålingerne. Derudover vil klyngeanalyse blive anvendt til at bestemme, om bivirkninger er tilsvarende relateret til ophidselsesniveauer og resultater for patienter i de tre behandlingsgrupper.

      OVERVÅGNINGSPROCEDURER/BIVIRKNINGER / SIKKERHEDSENDPOINT Overvågning Monitorerne vil besøge centret under undersøgelsen ud over at opretholde hyppig telefonisk og skriftlig kommunikation.

      Følgende retningslinjer opfylder kravene specificeret i 21 CFR §812.46 og er tilvejebragt for at beskrive procedurerne for overvågning af de kliniske undersøgelser. Hvis investigator ikke overholder den underskrevne Investigator Agreement, protokollen eller en hvilken som helst betingelse for undersøgelsen (f.eks. ufuldstændige dataformularer), har monitoren ret til at afslutte investigatorens deltagelse i undersøgelsen.

      Forundersøgelsesovervågningsprocedurer

      Den udpegede (dvs. monitor) vil være ansvarlig for at fastslå og dokumentere, at hver investigator klart forstår og accepterer det ansvar og de forpligtelser, der pådrages i forbindelse med udførelse af en klinisk undersøgelse. Monitoren vil sikre sig, før undersøgelsens påbegyndelse, at investigator:

      • Forstår kravene til en velkontrolleret undersøgelse;

      • Forstår karakteren af ​​den kliniske protokol

      • Forstår hans/hendes rapporteringsforpligtelser;

      • Forstår kravene til enhedsansvarlighed;

      • Forstår og accepterer forpligtelserne til at indhente informeret samtykke i overensstemmelse med 21 CFR Parts 50 og 56;

      • Forstår og accepterer forpligtelsen til at indhente IRB-gennemgang og godkendelse af den kliniske undersøgelse, før den påbegyndes, og til at sikre fortsat gennemgang af undersøgelsen af ​​IRB i overensstemmelse med 21 CFR Part 56, og at holde sponsoren informeret om alle IRB-handlinger vedr. Studiet;

      • Forstår og accepterer kravene vedrørende finansiel offentliggørelse af kliniske undersøgelser, 21 CFR Part 54;
      • Har tilstrækkelige faciliteter og adgang til et passende antal egnede emner til at udføre undersøgelsen;
      • Har den påkrævede dokumentation på fil, herunder IRB-godkendelse og en underskrevet investigator-aftale.

      Periodiske overvågningsbesøg • Overvågningsbesøg vil blive udført i overensstemmelse med FDA-retningslinjen for overvågning af kliniske undersøgelser - januar 1988.

      • Monitoren bør besøge hvert sted regelmæssigt for at sikre følgende:

      • Faciliteterne er fortsat tilstrækkelige og acceptable.

      • Protokollen følges korrekt.

      • IRB/IEC har godkendt eller fået besked om protokolændringer.

      • Nøjagtige, fuldstændige og aktuelle optegnelser vedligeholdes, og oplysningerne registreres.

      • Der indsendes nøjagtige, fuldstændige og rettidige rapporter om bivirkninger

      • Der er indhentet informeret samtykke.

      • Årsagen til en forsøgspersons tilbagetrækning fra undersøgelsen er dokumenteret.

      • Rapporter indsendes til IRB og sponsor.

      • Det relevante personale udfører studieaktiviteter.

      • Alle case-rapportformularer og anden dokumentation relateret til undersøgelsen vil blive gennemgået ved modtagelse, og webstedet vil straks blive underrettet om eventuelle mangler.

      Hyppighed af overvågningsbesøg a) Overvågningsbesøg vil blive gennemført i overensstemmelse med standard overvågningsprocedurer. Overvågningsbesøg vil blive bestemt på basis af flere faktorer, herunder: b) Undersøgelsens varighed; c) Antal udestående spørgsmål fra tidligere besøg; d) Antal tilmeldte fag; e) Antal efterforskere/lokaliteter; og f) Undersøgelsens kompleksitet.

      Studieafslutning Alle rutinemæssige overvågningsfunktioner skal udføres før undersøgelsesafslutningsbesøget. Studieafslutningsbesøget kan kombineres med et overvågningsbesøg. Følgende opgaver skal udføres ved det sidste besøg af monitoren.

   1. Mind efterforskeren om forpligtelsen til at opbevare journalerne. b) Udarbejde endelig overvågningsrapport for IEC.

   Rapporter om overvågningsbesøg

   Overvågningsrapporter skal udfyldes for alle besøg. Rapporter skal indeholde følgende oplysninger:

   a) Dato for besøget; b) Liste over tilstedeværende personale på studiestedet; c) Et resumé af resultaterne, problemerne