Iniezione intradiscale di plasma ricco di piastrine (PRP) arricchito con esosomi nella lombalgia cronica

La gestione della lombalgia cronica (LBP) ha contribuito al suo alto livello socioeconomico. Il disco intervertebrale rappresenta il 40% o più dei casi di LBP cronico. Le opzioni terapeutiche disponibili non migliorano la condizione degenerativa sottostante, sebbene ne risolvano i sintomi. Ciò indica la necessità di nuove terapie e/o interventi che trattino effettivamente le cause alla base del dolore discogenico. Le terapie biologiche mediante iniezione diretta di PRP nell'anello fibroso e nel nucleo polposo sembrano un'opzione efficace e fattibile.

Gli esosomi derivati ​​dal sangue possono potenzialmente trasmettere alcune delle proprietà uniche delle cellule staminali ad altre cellule staminali, facilitando il mantenimento, la differenziazione, l'auto-rinnovamento e la riparazione della staminalità.

Proponiamo di condurre uno studio clinico controllato, randomizzato, in doppio cieco per confrontare la sicurezza e l'efficacia degli esosomi nel LBP. Il consenso informato sarà ottenuto da tutti i soggetti prima della partecipazione allo studio.

Preparazione PRP:

Il campione di sangue (60 ml) sarà centrifugato a 600×g per 10 min per raccogliere la frazione plasmatica. E centrifugato a 4000×g per 15 min. Il plasma povero di piastrine (PPP) supernatante sarà quindi rimosso, lasciando 1 ml di PRP. Il PPP verrà fatto passare attraverso uno speciale filtro flush back progettato indigenamente da un micron (Alpha Corpuscle, Delhi, India) in modo che tutte le piastrine presenti nella frazione PPP rimangano intrappolate nel filtro. Queste piastrine intrappolate verranno risciacquate con 1 ml di PPP per recuperare la maggior parte delle piastrine. Questo sarà mescolato insieme e poi passato attraverso un filtro WBC (Terumo Imuguard, USA) per filtrare i leucociti. Il concentrato di PRP finale (0,1 ml) verrà analizzato per la conta totale dei leucociti e delle piastrine. Cinque campioni saranno selezionati in modo casuale trattati con trombina bovina ricostituita in cloruro di calcio al 10% saranno valutati per i fattori di crescita [fattori di crescita derivati ​​dalle piastrine (PDGF) e fattori di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF)] mediante ELISA.

In media il nostro campione di PRP avrà 100 miliardi di piastrine e un concentrato 30x di piastrine del sangue in 2 ml di PRP finale.

Preparazione degli esosomi:

Sessanta ml di sangue in provette rivestite con EDTA saranno centrifugati a 1.200 g per 10 minuti a 4°C per separare il plasma. Il plasma sarà filtrato con un filtro (0.22 μm). Evitare qualsiasi materiale pellettato durante il trasferimento del plasma. Scartare il materiale pellettato. Questo tubo ha un filtro speciale per concentrare gli esosomi e altre proteine ​​che promuovono la crescita. La provetta sarà centrifugata a 3000 g, RT, 30 min e gli esosomi saranno raccolti e quindi concentrati (da 0,5 ml a 3 ml). Per recuperare gli esosomi intasati nella parete del filtro, aggiungere 20 ml di NS (preferibilmente PBS) nella provetta da microcentrifuga e sciacquarla mediante centrifugazione a 3.500 g. Raccogli nuovamente la zuppa concentrata di esosomi che erano intasati nella parete del filtro.

La quantificazione del contenuto proteico sarà effettuata mediante analisi dell'acido bicinconinico (BCA).

Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) Le sospensioni di vescicole con concentrazioni comprese tra 1×107/ml e 1×109/ml saranno esaminate utilizzando un Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., Regno Unito) dotato di un laser a 405 nm per determinare la dimensione e la quantità di particelle isolato. Verrà registrato un video della durata di 60 secondi con un frame rate di 30 fotogrammi/sec e il movimento delle particelle verrà analizzato utilizzando il software NTA (versione 2.3; NanoSight Ltd.).

Analisi Western blot L'esosoma sopranatante sarà denaturato in tampone campione e sottoposto ad analisi western blot. Gli esosomi purificati saranno analizzati per l'espressione proteica HSP70, flottilina, CD63, TSG101 e calnexina. Le proteine ​​​​sono state visualizzate sul sistema Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Disegno dello studio I pazienti saranno randomizzati in 2 bracci per ricevere PRP con esosomi al centro del nucleo polposo o una quantità uguale di placebo e saranno valutati da 2 medici interventisti della colonna vertebrale e della medicina.

Randomizzazione e bracci dello studio:

Circa trecento pazienti verranno sottoposti a screening per l'assegnazione casuale a gruppi di trattamento o di controllo con un rapporto 1:1, per assegnare 30 pazienti a ciascun braccio 4:

1. Il braccio I verrà assegnato a ricevere il placebo (iniezione del punto trigger sotto il braccio C)

2. Braccio II: per ricevere PRP con esosomi al centro del nucleo polposo (2 ml) Prodotto/i di prova, dose e modalità di somministrazione durata del trattamento I pazienti saranno selezionati casualmente in base al numero generato dal computer per ricevere un'iniezione indistinguibile di PRP ex o placebo. Dopo la disinfezione cutanea della schiena, 2 ml del PRPex totale prelevato sono stati iniettati il ​​prima possibile mediante un approccio laterale guidato da fluoroscopia. I pazienti hanno ricevuto il placebo in modo simile, ma non per disc .it sarà nella zona muscolare attorno al punto di innesco. Il medico che ha valutato lo studio e il paziente non conoscevano il trattamento. Ai pazienti è stato consigliato di continuare con i soliti esercizi, le precauzioni di routine, la fisioterapia e la cura della schiena.

   Il paracetamolo (fino a un massimo di un grammo) tre volte al giorno potrà essere utilizzato come farmaco di soccorso. Durante lo studio non saranno consentiti corticosteroidi sistemici, potenziali farmaci/procedure che modificano i sintomi.

   Valutazioni dello studio / Misure di risultato

   1. Scala analogica visiva (VAS)
   2. Questionario sulla disabilità Roland Morris (RDQ)
   3. Questionario sanitario SF 36
   4. Indice di valutazione funzionale

   5. MRI - classificazione della degenerazione del disco, quantificazione T2 qualsiasi evidenza di discite I pazienti saranno valutati mediante scala analogica visiva (VAS), questionario sulla salute SF 36, indice di valutazione funzionale al basale e seguiti a 1, 3, 6 e 12 mesi. L'efficacia strutturale sarà valutata mediante quantificazione e classificazione MRI t2 come descritto in precedenza in letteratura al basale ea 6 mesi da due radiologi esperti. I valutatori saranno accecati.

      Le visite di monitoraggio saranno condotte secondo le procedure di monitoraggio standard.

      Verrà accertata l'interruzione del trattamento per giustificato motivo. Qualsiasi evidenza di infezione/discite sarà attentamente osservata. L'aggravamento del dolore sarà analizzato a fondo.

      I pazienti saranno valutati per eventuali effetti avversi e segni vitali una volta alla settimana per il primo mese e poi una volta al mese fino a 6 mesi. I campioni di sangue sono stati raccolti al momento dell'ingresso nello studio, a sei mesi, e durante una visita finale per esaminare le variabili biologiche e le funzioni epatiche e renali. È stata valutata la tollerabilità e sono stati eseguiti test ematologici e biochimici di laboratorio. Verrà inoltre valutata una possibile relazione causale con il braccio di trattamento.

      ANALISI STATISTICA:

      L'analisi della varianza (ANOVA) verrà utilizzata per studiare le differenze tra i gruppi. Le differenze nei campioni appaiati saranno confrontate utilizzando il test t di Student a due code. Le correlazioni tra variabili saranno valutate mediante la correlazione di Pearson. SPSS 20.0 verrà utilizzato per analisi statistiche (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0.05 sarà considerato statisticamente significativo.

      Identificazione della relazione tra problemi di sicurezza/effetti collaterali e livello di eccitazione mediante misurazione mediante scale di valutazione. Per verificare se la relazione tra problemi di sicurezza/effetti collaterali e livello di eccitazione differisce tra i gruppi IBRF ACP/MCP rispetto ai gruppi Standard of Care, utilizzando la misurazione per scale di valutazione, verranno condotte due analisi. La correlazione canonica verrà utilizzata per determinare quale effetto collaterale (o combinazione di effetti collaterali) spiega la varianza nelle misurazioni della scala di valutazione. Inoltre, verrà impiegata l'analisi dei cluster per determinare se gli effetti collaterali sono correlati in modo simile ai livelli di eccitazione e agli esiti per i pazienti nei tre gruppi di trattamento.

      PROCEDURE DI MONITORAGGIO/EVENTI AVVERSI/ENDPOINT DI SICUREZZA Monitoraggio Gli ispettori visiteranno il centro durante lo studio oltre a mantenere frequenti comunicazioni telefoniche e scritte.

      Le seguenti linee guida soddisfano i requisiti specificati in 21 CFR §812.46 e sono fornite per descrivere le procedure per il monitoraggio degli studi clinici. Se lo sperimentatore non rispetta l'Accordo dello sperimentatore firmato, il protocollo o qualsiasi condizione dello studio (ad esempio, moduli dati incompleti), il monitor ha il diritto di interrompere la partecipazione dello sperimentatore allo studio.

      Procedure di monitoraggio pre-studio

      Il designato (es. monitor) sarà responsabile di determinare e documentare che ogni ricercatore comprende chiaramente e accetta le responsabilità e gli obblighi derivanti dalla conduzione di uno studio clinico. Il monitor assicurerà prima dell'inizio dello studio che lo sperimentatore:

      • Comprende i requisiti per uno studio ben controllato;

      • Comprende la natura del protocollo clinico

      • Comprende i propri obblighi di segnalazione;

      • Comprende i requisiti per la responsabilità del dispositivo;

      • Comprende e accetta gli obblighi di ottenere il consenso informato in conformità con 21 CFR Parti 50 e 56;

      • Comprende e accetta l'obbligo di ottenere la revisione e l'approvazione dell'IRB dell'indagine clinica prima che venga avviata e di garantire la revisione continua dello studio da parte dell'IRB in conformità con 21 CFR Parte 56 e di tenere informato lo sponsor di tutte le azioni dell'IRB riguardanti lo studio;

      • Comprende e accetta i requisiti relativi alla divulgazione finanziaria delle indagini cliniche, 21 CFR Parte 54;
      • Dispone di strutture adeguate e accesso a un numero adeguato di soggetti idonei a condurre l'indagine;
      • Ha la documentazione richiesta in archivio, inclusa l'approvazione dell'IRB e un accordo di investigatore firmato.

      Visite di monitoraggio periodiche • Le visite di monitoraggio saranno condotte in conformità con la linea guida della FDA per il monitoraggio delle indagini cliniche - gennaio 1988.

      • Il monitor dovrebbe visitare ogni sito regolarmente per garantire quanto segue:

      • Le strutture continuano ad essere adeguate e accettabili.

      • Il protocollo viene seguito correttamente.

      • L'IRB/IEC ha approvato o ha ricevuto notifica di eventuali modifiche al protocollo.

      • Vengono mantenuti registri accurati, completi e aggiornati e le informazioni registrate.

      • Vengono presentate segnalazioni di eventi avversi accurate, complete e tempestive

      • È stato ottenuto il consenso informato.

      • Il motivo del ritiro di un soggetto dallo studio è stato documentato.

      • I rapporti vengono inviati all'IRB e allo sponsor.

      • Il personale appropriato sta svolgendo le attività di studio.

      • Tutti i moduli di segnalazione dei casi e altra documentazione relativa allo studio saranno esaminati al momento della ricezione e il centro sarà prontamente informato di eventuali carenze.

      Frequenza delle visite di monitoraggio a) Le visite di monitoraggio saranno condotte secondo le procedure di monitoraggio standard. Le visite di monitoraggio saranno determinate sulla base di diversi fattori, tra cui: b) Durata dello studio; c) Numero di problemi in sospeso da visite precedenti; d) Numero di soggetti iscritti; e) Numero di ricercatori/siti; e, f) Complessità dello studio.

      Conclusione dello studio Tutte le funzioni di monitoraggio di routine devono essere eseguite prima della visita di conclusione dello studio. La visita di fine studio può essere combinata con una visita di monitoraggio. Le seguenti attività dovrebbero essere completate durante l'ultima visita del monitor.

   1. Ricordare all'investigatore l'obbligo di conservare i registri. b) Preparare il rapporto di monitoraggio finale per l'IEC.

   Report delle visite di monitoraggio

   I rapporti di monitoraggio devono essere completati per tutte le visite. I rapporti devono includere le seguenti informazioni:

   a) Data della visita; b) Elenco del personale del sito di studio presente; c) Una sintesi dei risultati, problemi