Intradiskální injekce plazmy bohaté na krevní destičky (PRP) obohacené o exozomy při chronické bolesti dolní části zad

Léčba chronické bolesti dolní části zad (LBP) přispěla k jejímu vysokému socioekonomickému. Meziobratlová ploténka představuje 40 % nebo více případů chronické LBP. Dostupné možnosti léčby nezlepšují základní degenerativní stav, i když řeší jeho příznaky. To naznačuje potřebu nových terapií a/nebo intervencí, které skutečně léčí základní příčiny diskogenní bolesti. Biologická léčba přímou injekcí PRP do anulus fibrosus a nucleus pulposus se jeví jako účinná a proveditelná možnost.

Exozomy pocházející z krve mohou potenciálně přenášet některé z jedinečných vlastností kmenových buněk na jiné kmenové buňky, což usnadňuje udržování kmene, diferenciaci, sebeobnovu a opravu.

Navrhujeme provést kontrolovanou, randomizovanou, dvojitě zaslepenou klinickou studii pro srovnání bezpečnosti a účinnosti exozomů u LBP. Před účastí ve studii bude od všech subjektů získán informovaný souhlas.

Příprava PRP:

Vzorek krve (60 ml) bude centrifugován při 600 x g po dobu 10 minut, aby se shromáždila frakce plazmy. A centrifugováno při 4000 x g po dobu 15 minut. Supernatant plazma chudá na destičky (PPP) bude poté odstraněna a zůstane 1 ml PRP. PPP bude procházet přes jednomikronový speciální proplachovací filtr (Alpha Corpuscle, Dillí, Indie), takže všechny krevní destičky přítomné ve frakci PPP budou zachyceny ve filtru. Tyto zachycené krevní destičky budou propláchnuty zpět 1 ml PPP, aby se získala většina krevních destiček. To se smísí dohromady a poté se nechá projít filtrem WBC (Terumo Imuguard, USA), aby se odfiltrovaly leukocyty. Konečný koncentrát PRP (0,1 ml) bude analyzován na celkový počet leukocytů a krevních destiček. Vybere se pět vzorků náhodně ošetřených bovinním trombinem rekonstituovaným v 10% chloridu vápenatém a budou hodnoceny na růstové faktory [růstové faktory odvozené od krevních destiček (PDGF) a vaskulární endoteliální růstové faktory (VEGF)] pomocí ELISA.

Náš vzorek PRP bude mít v průměru 100 miliard krevních destiček a 30x koncentrát krevních destiček ve 2 ml konečného PRP.

Příprava exosomů:

Šedesát ml krve ve zkumavkách potažených EDTA bude rotováno při 1 200 g po dobu 10 minut při 4 °C, aby se oddělila plazma. Plazma bude filtrována filtrem (0,22 μm). Při přenosu plazmy se vyvarujte jakéhokoli peletovaného materiálu. Peletovaný materiál zlikvidujte. Tato zkumavka má speciální filtr pro koncentraci exosomů a dalších proteinů podporujících růst. Zkumavka bude centrifugována při 3000 g, RT, 30 min a exosomy budou odebrány a poté budou zakoncentrovány (0,5 ml až 3 ml). Pro obnovu exosomů ucpaných ve stěně filtru přidejte 20 ml NS (nejlépe PBS) do mikrocentrifugační zkumavky a propláchněte ji centrifugací při 3500 g. Znovu seberte koncentrovanou polévku exosomů, které byly ucpané ve stěně filtru.

Kvantifikace obsahu proteinu bude provedena stanovením kyseliny bicinchoninové (BCA).

Analýza sledování nanočástic (NTA) Suspenze vezikul s koncentracemi mezi 1×107/ml a 1×109/ml budou zkoumány pomocí Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., UK) vybaveného laserem 405 nm pro určení velikosti a množství částic. izolovaný. Video o délce 60 sekund bude pořízeno se snímkovou frekvencí 30 snímků/s a pohyb částic bude analyzován pomocí softwaru NTA (verze 2.3; NanoSight Ltd.).

Analýza Western blot Exosomový supernatant bude denaturován ve vzorkovém pufru a bude podroben analýze Western blot. Purifikované exosomy budou analyzovány na proteinovou expresi HSP70, flottilin, CD63, TSG101 a kalnexin. Proteiny byly vizualizovány na systému Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Uspořádání studie Pacienti budou randomizováni do 2 ramen buď pro příjem PRP s exozomy ve středu nucleus pulposus nebo stejným množstvím placeba a budou hodnoceni 2 intervenčními páteřními a lékařskými lékaři.

Randomizace a ramena studie:

Přibližně 300 pacientů bude podrobeno screeningu, aby byli náhodně rozděleni do léčebných nebo kontrolních skupin v poměru 1:1, aby bylo rozděleno 30 pacientů do každé 4 větve:

1. Rameno I bude přiděleno k podávání placeba (injekce spouštěcího bodu pod ramenem C)

2. Rameno II: dostávat PRP s exosomy ve středu pulposního jádra (2 ml) Testovaný produkt(y), dávka a způsob podávání trvání léčby Pacienti budou náhodně vybráni na základě počítačem generovaného počtu, kteří dostanou jednu nerozlišitelnou injekci PRP ex nebo placebo. Po dezinfekci kůže zad byly co nejdříve injikovány 2 ml z celkového získaného PRPex laterálním přístupem řízeným skiaskopií. Pacienti dostávali placebo podobným způsobem, ale ne na disk bude ve svalové zóně kolem spouštěcího bodu. Lékař, který hodnotil studii, a pacient byli neznámí léčby. Pacientům bylo doporučeno pokračovat v obvyklém cvičení, rutinních opatřeních, fyzioterapii a péči o záda.

   Jako záchranný lék bude povoleno používat paracetamol (maximálně do jednoho gramu) třikrát denně. Během studie nebudou povoleny žádné systémové kortikosteroidy, potenciální léčivo/postup modifikující symptomy.

   Hodnocení studie / Měření výsledků

   1. Vizuální analogová stupnice (VAS)
   2. Roland Morris Disability Questionnaire (RDQ)
   3. SF 36 zdravotní dotazník
   4. Index funkčního hodnocení

   5. MRI - klasifikace degenerace ploténky, kvantifikace T2 jakékoli známky diskitidy Pacienti budou hodnoceni pomocí vizuální analogové škály (VAS), zdravotního dotazníku SF 36, indexu funkčního hodnocení na začátku a sledováni po 1, 3, 6 a 12 měsících. Strukturální účinnost bude hodnocena MRI t2 kvantifikací a klasifikací, jak bylo popsáno dříve v literatuře na začátku a po 6 měsících dvěma zkušenými radiology. Hodnotitelé budou zaslepeni.

      Monitorovací návštěvy budou prováděny podle standardních monitorovacích postupů.

      Přerušení léčby z konkrétního důvodu bude zjištěno. Jakékoli známky infekce/discitidy budou pečlivě sledovány. Zhoršení bolesti bude hluboce analyzováno.

      Pacienti budou hodnoceni na případné nežádoucí účinky a vitální funkce jednou týdně po dobu prvního měsíce a poté jednou měsíčně až po dobu 6 měsíců. Vzorky krve byly odebrány v době vstupu do studie, po šesti měsících a při poslední návštěvě, aby se prozkoumaly biologické proměnné a také funkce jater a ledvin. Byla hodnocena snášenlivost a byly provedeny laboratorní hematologické a biochemické testy. Posouzena bude také možná příčinná souvislost s léčebným ramenem.

      STATISTICKÁ ANALÝZA:

      Ke zkoumání rozdílů mezi skupinami bude použita analýza rozptylu (ANOVA). Rozdíly v párových vzorcích budou porovnány pomocí dvoustranného Studentova t-testu. Korelace mezi proměnnými budou posuzovány Pearsonovou korelací. Pro statistické analýzy bude použit SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 bude považováno za statisticky významné.

      Identifikace vztahu mezi bezpečnostními problémy/vedlejšími účinky a úrovní vzrušení pomocí měření hodnotícími stupnicemi. Aby se otestovalo, zda se vztah mezi bezpečnostními problémy/vedlejšími účinky a úrovní vzrušení liší mezi skupinami IBRF ACP/MCP vs. skupinami Standard of Care, pomocí měření pomocí hodnotících škál, budou provedeny dvě analýzy. Kanonická korelace bude použita k určení, který vedlejší účinek (nebo kombinace vedlejších účinků) vysvětluje odchylku v měření hodnoticí stupnice. Kromě toho bude použita shluková analýza k určení, zda vedlejší účinky podobně souvisí s úrovněmi vzrušení a výsledky u pacientů ve třech léčebných skupinách.

      MONITOROVACÍ POSTUPY / NEŽÁDOUCÍ UDÁLOSTI / BEZPEČNOSTNÍ KONCOVÉ BODY Monitorování Kromě časté telefonické a písemné komunikace budou monitorující během studie navštěvovat centrum.

      Následující pokyny splňují požadavky uvedené v 21 CFR § 812.46 a slouží k popisu postupů pro monitorování klinických studií. Pokud zkoušející nedodržuje podepsanou dohodu zkoušejícího, protokol nebo jakoukoli podmínku studie (např. neúplné datové formuláře), monitorující má právo ukončit účast zkoušejícího ve studii.

      Postupy sledování před studiem

      Označení (tj. monitor) bude odpovědný za určení a zdokumentování toho, že každý zkoušející jasně rozumí a přijímá odpovědnost a povinnosti vyplývající z provádění klinické studie. Monitor před zahájením studie zajistí, že zkoušející:

      • Rozumí požadavkům na dobře řízenou studii;

      • Rozumí povaze klinického protokolu

      • rozumí svým ohlašovacím povinnostem;

      • Rozumí požadavkům na odpovědnost zařízení;

      • Chápe a přijímá povinnosti získat informovaný souhlas v souladu s 21 CFR Části 50 a 56;

      • Chápe a přijímá povinnost získat kontrolu IRB a schválení klinické zkoušky před jejím zahájením a zajistit průběžnou kontrolu studie ze strany IRB v souladu s 21 CFR Part 56 a průběžně informovat zadavatele o všech akcích IRB týkajících se studium; studie;

      • Chápe a přijímá požadavky týkající se finančního zveřejňování klinických zkoušek, 21 CFR Part 54;
      • má odpovídající zařízení a přístup k přiměřenému počtu vhodných subjektů pro provádění vyšetřování;
      • Má v evidenci požadovanou dokumentaci, včetně souhlasu IRB a podepsané smlouvy s vyšetřovatelem.

      Periodické monitorovací návštěvy • Monitorovací návštěvy budou prováděny v souladu se směrnicí FDA pro monitorování klinických vyšetření – leden 1988.

      • Monitor by měl každé místo pravidelně navštěvovat, aby zajistil následující:

      • Vybavení je i nadále přiměřené a přijatelné.

      • Protokol je správně dodržován.

      • IRB/IEC schválila jakékoli změny protokolu nebo byla o nich informována.

      • Jsou udržovány přesné, úplné a aktuální záznamy a zaznamenávají se informace.

      • Jsou předkládána přesná, úplná a včasná hlášení nežádoucích příhod

      • Byl získán informovaný souhlas.

      • Důvod pro odstoupení subjektu ze studie byl zdokumentován.

      • Zprávy jsou předkládány IRB a sponzorovi.

      • Studijní aktivity provádějí příslušní pracovníci.

      • Všechny formuláře případových zpráv a další dokumentace související se studií budou po obdržení zkontrolovány a pracoviště bude neprodleně informováno o jakýchkoli nedostatcích.

      Četnost monitorovacích návštěv a) Monitorovací návštěvy budou prováděny podle standardních monitorovacích postupů. Monitorovací návštěvy budou určeny na základě několika faktorů, včetně: b) trvání studie; c) Počet nevyřešených problémů z předchozích návštěv; d) počet zapsaných předmětů; e) Počet zkoušejících/míst; a f) Složitost studie.

      Ukončení studie Všechny rutinní monitorovací funkce musí být provedeny před návštěvou ukončení studie. Návštěva ukončení studie může být kombinována s monitorovací návštěvou. Následující úkoly by měly být dokončeny při poslední návštěvě monitoru.

   1. Připomeňte vyšetřovateli povinnost uchovávat záznamy. b) Připravit závěrečnou monitorovací zprávu pro IEC.

   Zprávy o monitorovacích návštěvách

   Monitorovací zprávy musí být vyplněny pro všechny návštěvy. Zprávy musí obsahovat následující informace:

   a) Datum návštěvy; b) seznam přítomných pracovníků pracoviště; c) Shrnutí poznatků, problémů