만성 요통에 엑소좀이 풍부한 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 디스크 내 주입

만성 요통(LBP)의 관리는 높은 사회경제적 요인에 기여했습니다. 추간판은 만성 요통의 40% 이상을 차지합니다. 사용 가능한 치료 옵션은 증상을 해결하지만 근본적인 퇴행성 상태를 개선하지 않습니다. 이는 추간판성 통증의 근본적인 원인을 실제로 치료하는 새로운 치료법 및/또는 중재가 필요함을 나타냅니다. PRP를 섬유륜과 수핵에 직접 주입하는 생물학적 요법은 효과적이고 실행 가능한 옵션으로 보입니다.

혈액에서 추출한 엑소좀은 잠재적으로 고유한 줄기 세포 특성 중 일부를 다른 줄기 세포로 전달하여 줄기 세포의 유지, 분화, 자가 재생 및 복구를 촉진할 수 있습니다.

우리는 LBP에서 엑소좀의 안전성과 효능을 비교하기 위해 통제된 무작위 이중 맹검 임상 시험을 제안합니다. 연구 참여 전에 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻을 것입니다.

PRP 준비:

혈액 샘플(60ml)을 600xg에서 10분 동안 원심분리하여 혈장 분획을 수집합니다. 그리고 4000×g에서 15분간 원심분리한다. 그런 다음 상청액 혈소판 불량 혈장(PPP)을 제거하고 1ml PRP를 남깁니다. PPP는 1미크론의 특수 고유 설계 플러시 백 필터(인도 델리의 Alpha Corpuscle)를 통과하여 PPP 분획에 존재하는 모든 혈소판이 필터에 갇히게 됩니다. 이렇게 갇힌 혈소판은 1ml의 PPP로 다시 플러시되어 대부분의 혈소판을 회수합니다. 이것을 함께 혼합한 다음 WBC 필터(Terumo Imuguard, USA)를 통과시켜 백혈구를 걸러냅니다. 최종 PRP 농축물(0.1ml)은 총 백혈구 및 혈소판 수에 대해 분석됩니다. 10% 염화칼슘으로 재구성된 소 트롬빈으로 무작위로 처리된 5개의 샘플이 ELISA에 의해 성장 인자[혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)]에 대해 평가될 것입니다.

평균적으로 우리의 PRP 샘플은 최종 PRP 2ml에 1000억 개의 혈소판과 30배 농축된 혈소판을 포함합니다.

엑소좀 준비:

EDTA 코팅된 튜브의 혈액 60ml를 4°C에서 10분 동안 1,200g에서 회전시켜 혈장을 분리합니다. 플라즈마는 (0.22 μm) 필터로 필터링됩니다. 플라즈마를 옮기는 동안 펠렛 재료를 피하십시오. 펠렛 재료를 폐기하십시오. 이 튜브에는 엑소좀 및 기타 성장 촉진 단백질을 농축하는 특수 필터가 있습니다. 튜브를 3000g, RT, 30분에서 원심분리하고 엑소좀을 수집한 다음 농축합니다(0.5ml에서 3ml). 필터 벽에 막힌 엑소좀을 회수하기 위해 - 20 ml NS(바람직하게는 PBS)를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 3,500 g에서 원심분리하여 헹구어 냅니다. 필터벽에 막혔던 엑소좀 농축액을 다시 모아줍니다.

단백질 함량의 정량화는 BCA(bicinchoninic acid) 분석으로 수행됩니다.

나노입자 추적 분석(NTA) 1×107/ml에서 1×109/ml 사이의 농도를 가진 소포 현탁액은 입자의 크기와 양을 결정하기 위해 405nm 레이저가 장착된 Nanosight NS300(NanoSight Ltd., UK)을 사용하여 검사됩니다. 외딴. 60초 길이의 비디오는 30 프레임/초의 프레임 속도로 촬영되며 입자 움직임은 NTA 소프트웨어(버전 2.3; NanoSight Ltd.)를 사용하여 분석됩니다.

웨스턴 블롯 분석 엑소좀 상청액은 샘플 버퍼에서 변성되고 웨스턴 블롯 분석을 받게 됩니다. 정제된 엑소좀은 단백질 발현 HSP70, 플로틸린, CD63, TSG101 및 칼넥신에 대해 분석될 것입니다. 단백질은 Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager 시스템(Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA)에서 시각화되었습니다.

연구 설계 환자는 수핵의 중심에 엑소좀이 있는 PRP 또는 동일한 양의 위약을 받는 2개의 팔로 무작위 배정되고 2명의 중재적 척추 및 의학 의사가 평가할 것입니다.

연구의 무작위화 및 무기:

약 300명의 환자를 스크리닝하여 1:1 비율로 치료군 ​​또는 대조군에 무작위로 할당하여 30명의 환자를 각 4개 부문에 할당합니다.

1. 팔 I은 위약을 받도록 지정됩니다(C 팔 아래 트리거 포인트 주사).

2. 팔 II: 수핵 중앙에 엑소좀이 있는 PRP(2ml)를 투여하기 위해 테스트 제품(들), 용량 및 투여 방식 치료 기간 컴퓨터 생성 번호에 따라 환자를 무작위로 선택하여 식별할 수 없는 PRP ex 주사를 1회 투여합니다. 또는 위약. 뒷면의 피부 소독 후 조달된 총 PRPex에서 2ml를 형광투시 유도 측면 접근 방식으로 가능한 한 빨리 주입했습니다. 환자들은 위약을 비슷한 방식으로 받았지만 디스크는 받지 않았습니다. 트리거 포인트 주변의 근육 영역에 있을 것입니다. 연구를 평가한 의사와 환자는 치료에 대해 알지 못했습니다. 환자들은 일상적인 운동, 일상적인 예방 조치, 물리 치료 및 허리 관리를 계속하도록 권고받았습니다.

   Paracetamol(최대 1g까지)을 하루에 세 번 구조 약물로 사용할 수 있습니다. 전신 코르티코스테로이드, 잠재적인 증상 조절 약물/시술은 연구 기간 동안 허용되지 않습니다.

   연구 평가 / 결과 측정

   1. 비주얼 아날로그 스케일(VAS)
   2. Roland Morris 장애 설문지(RDQ)
   3. SF 36 건강 설문지
   4. 기능 등급 지수

   5. MRI - 디스크 변성 등급, T2 정량화 디스크염의 모든 증거 환자는 시각적 아날로그 척도(VAS), SF 36 건강 설문지, 기준선에서 기능 등급 지수로 평가되고 1, 3, 6 및 12개월에 추적됩니다. 구조적 효능은 2명의 숙련된 방사선 전문의에 의해 기준선 및 6개월에 앞서 문헌에 기술된 바와 같이 MRI t2 정량화 및 등급화에 의해 평가될 것입니다. 평가자는 눈이 멀게 됩니다.

      모니터링 방문은 표준 모니터링 절차에 따라 수행됩니다.

      특정 사유로 치료 중단이 확인됩니다. 감염/추간염의 모든 증거를 섬세하게 관찰합니다. 통증의 악화를 심층 분석합니다.

      환자는 첫 달 동안 일주일에 한 번, 최대 6개월까지 한 달에 한 번 부작용 및 활력 징후에 대해 평가됩니다. 생물학적 변수와 간 및 신장 기능을 검사하기 위해 연구 시작 시점, 6개월 시점 및 최종 방문 시 혈액 샘플을 수집했습니다. 내약성을 평가하고 실험실 기반 혈액학적 및 생화학적 분석을 수행했습니다. 치료 부문과의 가능한 인과 관계도 평가됩니다.

      통계 분석:

      분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 차이를 조사합니다. 짝을 이룬 샘플의 차이는 양측 스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 비교됩니다. 변수 간의 상관관계는 Pearson의 상관관계로 평가됩니다. SPSS 20.0은 통계 분석에 사용됩니다(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

      등급 척도에 의한 측정을 통한 안전성 문제/부작용과 각성 수준 간의 관계 파악. IBRF ACP/MCP와 Standard of Care 그룹 간에 안전성 문제/부작용 및 각성 수준 간의 관계가 다른지 여부를 테스트하기 위해 평가 척도에 의한 측정을 사용하여 두 가지 분석을 수행합니다. 정식 상관 관계는 등급 척도 측정의 분산을 설명하는 부작용(또는 부작용의 조합)을 결정하는 데 사용됩니다. 또한 클러스터 분석을 사용하여 부작용이 세 치료 그룹의 환자에 대한 각성 수준 및 결과와 유사하게 관련되는지 여부를 결정합니다.

      모니터링 절차/이상 사건/안전 종점 모니터링 모니터는 빈번한 전화 및 서면 통신을 유지하는 것 외에도 연구 기간 동안 센터를 방문합니다.

      다음 지침은 21 CFR §812.46에 지정된 요구 사항을 충족하며 임상 연구 모니터링 절차를 설명하기 위해 제공됩니다. 조사자가 서명한 조사자 동의서, 프로토콜 또는 연구 조건(예: 불완전한 데이터 양식)을 준수하지 않는 경우 모니터는 조사자의 연구 참여를 종료할 권리가 있습니다.

      사전 연구 모니터링 절차

      지정(즉, 모니터)는 각 조사자가 임상 연구를 수행할 때 발생하는 책임과 의무를 명확하게 이해하고 수락하는지 결정하고 문서화할 책임이 있습니다. 모니터는 조사자가 연구를 시작하기 전에 다음을 확인합니다.

      • 잘 통제된 연구에 대한 요구 사항을 이해합니다.

      • 임상 프로토콜의 특성을 이해합니다.

      • 자신의 보고 의무를 이해합니다.

      • 장치 책임에 대한 요구 사항을 이해합니다.

      • 21 CFR 파트 50 및 56에 따라 정보에 입각한 동의를 얻어야 하는 의무를 이해하고 수락합니다.

      • 임상 조사가 시작되기 전에 임상 조사에 대한 IRB 검토 및 승인을 획득하고 21 CFR Part 56에 따라 IRB가 연구를 지속적으로 검토하도록 보장하고 후원자에게 다음과 같은 모든 IRB 조치에 대해 알릴 의무를 이해하고 수락합니다. 연구;

      • 21 CFR Part 54, 임상 조사의 재무 공개에 관한 요구 사항을 이해하고 수락합니다.
      • 조사를 수행할 수 있는 적절한 시설과 적절한 수의 적절한 피험자에 대한 접근성이 있습니다.
      • IRB 승인 및 서명된 조사자 동의서를 포함하여 파일에 필요한 문서가 있습니다.

      정기 모니터링 방문 • 모니터링 방문은 임상 조사 모니터링에 대한 FDA 지침 - 1988년 1월에 따라 수행됩니다.

      • 모니터는 각 현장을 정기적으로 방문하여 다음을 확인해야 합니다.

      • 시설은 계속 적절하고 수용 가능합니다.

      • 프로토콜을 올바르게 준수하고 있습니다.

      • IRB/IEC는 모든 프로토콜 변경을 승인했거나 통보 받았습니다.

      • 정확하고 완전한 최신 기록을 유지하고 정보를 기록합니다.

      • 정확하고 완전하며 시의적절한 부작용 보고서가 제출되고 있습니다.

      • 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

      • 피험자가 연구에서 탈퇴한 이유가 문서화되었습니다.

      • 보고서는 IRB와 스폰서에게 제출되고 있습니다.

      • 해당 직원이 학습 활동을 수행하고 있습니다.

      • 연구와 관련된 모든 증례 보고서 양식 및 기타 문서는 접수 즉시 검토되며 결함이 있는 경우 현장에 즉시 통보됩니다.

      모니터링 방문 빈도 a) 모니터링 방문은 표준 모니터링 절차에 따라 수행됩니다. 모니터링 방문은 다음을 포함한 여러 요인에 따라 결정됩니다. b) 연구 기간; c) 이전 방문에서 미결 문제의 수; d) 등록된 피험자 수; e) 조사자/현장의 수; f) 연구의 복잡성.

      연구 종료 모든 일상적인 모니터링 기능은 연구 종료 방문 전에 수행되어야 합니다. 연구 종료 방문은 모니터링 방문과 결합될 수 있습니다. 모니터가 마지막으로 방문했을 때 다음 작업을 완료해야 합니다.

   1. 조사관에게 기록 보관 의무를 상기시킵니다. b) IEC에 대한 최종 모니터링 보고서를 준비합니다.

   모니터링 방문 보고서

   모든 방문에 대해 모니터링 보고서를 작성해야 합니다. 보고서에는 다음 정보가 포함되어야 합니다.

   a) 방문 날짜 b) 참석한 연구 기관 인원 목록; c) 조사 결과 요약, 문제점