Intradiskale Injektion von mit Exosomen angereichertem plättchenreichem Plasma (PRP) bei chronischen Rückenschmerzen

Die Behandlung von chronischen Kreuzschmerzen (LBP) hat zu ihrem hohen sozioökonomischen Niveau beigetragen. Die Bandscheibe ist für mindestens 40 % der Fälle von chronischem LBP verantwortlich. Verfügbare Behandlungsoptionen verbessern die zugrunde liegende degenerative Erkrankung nicht, obwohl sie ihre Symptome beseitigen. Dies weist auf die Notwendigkeit neuer Therapien und/oder Interventionen hin, die tatsächlich die zugrunde liegenden Ursachen von diskogenen Schmerzen behandeln. Biologische Therapien durch direkte Injektion von PRP in den Annulus fibrosus und den Nucleus pulposus scheinen eine wirksame und durchführbare Option zu sein.

Aus Blut gewonnene Exosomen können möglicherweise einige der einzigartigen Eigenschaften von Stammzellen auf andere Stammzellen übertragen, was die Aufrechterhaltung der Stammzellen, Differenzierung, Selbsterneuerung und Reparatur erleichtert.

Wir schlagen vor, eine kontrollierte, randomisierte, doppelblinde klinische Studie durchzuführen, um die Sicherheit und Wirksamkeit von Exosomen bei LBP zu vergleichen. Vor der Teilnahme an der Studie wird von allen Probanden eine Einverständniserklärung eingeholt.

PRP-Vorbereitung:

Die Blutprobe (60 ml) wird 10 Minuten lang bei 600 × g zentrifugiert, um die Plasmafraktion zu sammeln. Und bei 4000 xg für 15 min zentrifugiert. Überstehendes plättchenarmes Plasma (PPP) wird dann entfernt, wobei 1 ml PRP zurückbleibt. PPP wird durch einen speziell von Einheimischen entworfenen 1-Mikron-Rückspülfilter (Alpha Corpuscle, Delhi, Indien) geleitet, so dass alle in der PPP-Fraktion vorhandenen Blutplättchen im Filter eingeschlossen werden. Diese eingeschlossenen Blutplättchen werden mit 1 ml PPP zurückgespült, um die meisten Blutplättchen wiederzugewinnen. Dies wird zusammengemischt und dann durch einen WBC-Filter (Terumo Imuguard, USA) geleitet, um die Leukozyten abzufiltrieren. Das endgültige PRP-Konzentrat (0,1 ml) wird auf die Gesamtzahl der Leukozyten und Blutplättchen analysiert. Fünf Proben werden zufällig ausgewählt und mit in 10 % Calciumchlorid rekonstituiertem Rinderthrombin behandelt und mittels ELISA auf Wachstumsfaktoren [aus Blutplättchen stammende Wachstumsfaktoren (PDGF) und vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (VEGF)] untersucht.

Im Durchschnitt enthält unsere PRP-Probe 100 Milliarden Blutplättchen und das 30-fache Blutplättchenkonzentrat in 2 ml endgültigem PRP.

Vorbereitung der Exosomen:

60 ml Blut in EDTA-beschichteten Röhrchen werden bei 1.200 g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um das Plasma abzutrennen. Das Plasma wird mit einem (0,22 μm) Filter gefiltert. Vermeiden Sie jegliches pelletiertes Material, während Sie das Plasma übertragen. Entsorgen Sie das pelletierte Material. Dieses Röhrchen hat einen speziellen Filter, um Exosomen und andere wachstumsfördernde Proteine ​​zu konzentrieren. Das Röhrchen wird bei 3000 g, RT, 30 min zentrifugiert und die Exosomen werden gesammelt und dann konzentriert (0,5 ml bis 3 ml). Um in der Filterwand verstopfte Exosomen wiederzugewinnen, fügen Sie 20 ml NS (vorzugsweise PBS) in das Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und spülen Sie es durch Zentrifugation bei 3.500 g. Sammeln Sie die konzentrierte Suppe von Exosomen erneut, die in der Filterwand verstopft waren.

Die Quantifizierung des Proteingehalts erfolgt durch einen Bicinchoninsäure(BCA)-Assay.

Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) Vesikelsuspensionen mit Konzentrationen zwischen 1×107/ml und 1×109/ml werden mit einem Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., UK) untersucht, das mit einem 405-nm-Laser ausgestattet ist, um die Größe und Menge der Partikel zu bestimmen isoliert. Ein Video mit einer Dauer von 60 Sekunden wird mit einer Bildrate von 30 Bildern/Sek. aufgenommen, und die Partikelbewegung wird mit der NTA-Software (Version 2.3; NanoSight Ltd.) analysiert.

Western-Blot-Analyse Der Exosomenüberstand wird in Probenpuffer denaturiert und einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Gereinigte Exosomen werden auf die Proteinexpression HSP70, Flottilin, CD63, TSG101 und Calnexin analysiert. Die Proteine ​​wurden auf dem Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager-System (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA) sichtbar gemacht.

Studiendesign Die Patienten werden randomisiert in 2 Arme eingeteilt, die entweder PRP mit Exosomen in der Mitte des Nucleus pulposus oder eine gleiche Menge Placebo erhalten, und werden von 2 Ärzten für interventionelle Wirbelsäulen- und Medizinmedizin bewertet.

Randomisierung und Studienarme:

Ungefähr 300 Patienten werden gescreent, um sie zufällig Behandlungs- oder Kontrollgruppen im Verhältnis 1:1 zuzuweisen, um 30 Patienten jedem 4-Arm zuzuordnen:

1. Arm I wird zugewiesen, um Placebo zu erhalten (Triggerpunkt-Injektion unter C-Arm)

2. Arm II: Erhalt von PRP mit Exosomen im Zentrum des Nucleus pulposus (2 ml) Testprodukt(e), Dosis und Art der Verabreichung Dauer der Behandlung Die Patienten werden nach dem Zufallsprinzip basierend auf einer computergenerierten Nummer ausgewählt, um eine nicht unterscheidbare Injektion von PRP ex zu erhalten oder Placebos. Nach der Hautdesinfektion des Rückens wurden 2 ml des insgesamt beschafften PRPex so schnell wie möglich durch einen fluoroskopisch geführten seitlichen Zugang injiziert. Die Patienten erhielten das Placebo in ähnlicher Weise, jedoch nicht gegen Disc wird sich in der Muskelzone um den Triggerpunkt befinden. Dem Arzt, der die Studie auswertete, und dem Patienten war die Behandlung unbekannt. Den Patienten wurde geraten, mit den üblichen Übungen, routinemäßigen Vorsichtsmaßnahmen, Physiotherapie und Rückenpflege fortzufahren.

   Paracetamol (maximal bis zu einem Gramm) dreimal täglich darf als Notfallmedikament verwendet werden. Während der Studie ist kein systemisches Kortikosteroid, potenziell symptommodifizierendes Medikament / Verfahren erlaubt.

   Studienbewertungen / Ergebnismessungen

   1. Visuelle Analogskala (VAS)
   2. Roland Morris-Behindertenfragebogen (RDQ)
   3. Gesundheitsfragebogen SF 36
   4. Funktionaler Bewertungsindex

   5. MRT – Einstufung der Bandscheibendegeneration, T2-Quantifizierung jeglicher Hinweise auf eine Bandscheibenentzündung Die strukturelle Wirksamkeit wird durch MRT-t2-Quantifizierung und Einstufung, wie zuvor in der Literatur beschrieben, zu Studienbeginn und nach 6 Monaten von zwei erfahrenen Radiologen bewertet. Assessoren werden geblendet.

      Überwachungsbesuche werden gemäß Standardüberwachungsverfahren durchgeführt.

      Ein Abbruch der Behandlung aus einem bestimmten Grund wird festgestellt. Jegliche Anzeichen einer Infektion/Diskitis werden sorgfältig beobachtet. Schmerzverschlimmerung wird eingehend analysiert.

      Die Patienten werden im ersten Monat einmal wöchentlich und dann bis zu 6 Monate einmal monatlich auf Nebenwirkungen und Vitalfunktionen untersucht. Blutproben wurden zum Zeitpunkt des Eintritts in die Studie, nach sechs Monaten und bei einem letzten Besuch entnommen, um biologische Variablen sowie Leber- und Nierenfunktionen zu untersuchen. Die Verträglichkeit wurde bewertet und es wurden laborbasierte hämatologische und biochemische Tests durchgeführt. Ein möglicher kausaler Zusammenhang mit dem Behandlungsarm wird ebenfalls bewertet.

      STATISTISCHE ANALYSE:

      Die Varianzanalyse (ANOVA) wird verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu untersuchen. Unterschiede in gepaarten Stichproben werden unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests verglichen. Korrelationen zwischen Variablen werden anhand der Pearson-Korrelation bewertet. Für statistische Auswertungen wird SPSS 20.0 verwendet (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P < 0,05 wird als statistisch signifikant angesehen.

      Identifizierung des Zusammenhangs zwischen Sicherheitsaspekten/Nebenwirkungen und Erregungsniveau durch Messung anhand von Bewertungsskalen. Um zu testen, ob sich die Beziehung zwischen Sicherheitsproblemen/Nebenwirkungen und Erregungsniveau zwischen IBRF ACP/MCP- und Standard-of-Care-Gruppen unterscheidet, werden zwei Analysen durchgeführt, wobei die Messung anhand von Bewertungsskalen verwendet wird. Die kanonische Korrelation wird verwendet, um zu bestimmen, welche Nebenwirkung (oder Kombination von Nebenwirkungen) die Varianz in den Messungen der Bewertungsskala erklärt. Darüber hinaus wird eine Clusteranalyse eingesetzt, um festzustellen, ob Nebenwirkungen in ähnlicher Weise mit dem Erregungsniveau und den Ergebnissen für Patienten in den drei Behandlungsgruppen zusammenhängen.

      ÜBERWACHUNGSVERFAHREN/NEBENWIRKENDE EREIGNISSE/SICHERHEITSENDPUNKTE Überwachung Die Überwacher besuchen das Zentrum während der Studie zusätzlich zu ihrer regelmäßigen telefonischen und schriftlichen Kommunikation.

      Die folgenden Richtlinien erfüllen die in 21 CFR §812.46 festgelegten Anforderungen und werden bereitgestellt, um die Verfahren zur Überwachung der klinischen Studien zu beschreiben. Wenn der Prüfarzt die unterzeichnete Prüfarztvereinbarung, das Protokoll oder eine Bedingung der Studie (z. B. unvollständige Datenformulare) nicht einhält, hat der Monitor das Recht, die Teilnahme des Prüfarztes an der Studie zu beenden.

      Überwachungsverfahren vor der Studie

      Die Bezeichnung (d.h. Monitor) ist dafür verantwortlich, festzustellen und zu dokumentieren, dass jeder Prüfer die Verantwortlichkeiten und Verpflichtungen, die mit der Durchführung einer klinischen Studie verbunden sind, klar versteht und akzeptiert. Der Monitor stellt vor Beginn der Studie sicher, dass der Prüfarzt:

      • versteht die Anforderungen für eine gut kontrollierte Studie;

      • Versteht die Art des klinischen Protokolls

      • versteht seine/ihre Meldepflichten;

      • Versteht die Anforderungen für die Rechenschaftspflicht von Geräten;

      • Versteht und akzeptiert die Verpflichtungen zur Einholung einer Einverständniserklärung gemäß 21 CFR Teile 50 und 56;

      • Versteht und akzeptiert die Verpflichtung, eine Überprüfung und Genehmigung der klinischen Prüfung durch das IRB einzuholen, bevor sie eingeleitet wird, und eine kontinuierliche Überprüfung der Studie durch das IRB gemäß 21 CFR Part 56 sicherzustellen und den Sponsor über alle diesbezüglichen Maßnahmen des IRB auf dem Laufenden zu halten die Studium;

      • Versteht und akzeptiert die Anforderungen bezüglich der finanziellen Offenlegung klinischer Prüfungen, 21 CFR Part 54;
      • Verfügt über angemessene Einrichtungen und Zugang zu einer angemessenen Anzahl geeigneter Probanden, um die Untersuchung durchzuführen;
      • Verfügt über die erforderlichen Unterlagen, einschließlich der IRB-Zulassung und einer unterzeichneten Prüfarztvereinbarung.

      Regelmäßige Überwachungsbesuche • Überwachungsbesuche werden gemäß der FDA-Richtlinie für die Überwachung klinischer Untersuchungen – Januar 1988 – durchgeführt.

      • Der Monitor sollte jeden Standort regelmäßig besuchen, um Folgendes sicherzustellen:

      • Die Einrichtungen sind weiterhin angemessen und akzeptabel.

      • Das Protokoll wird ordnungsgemäß befolgt.

      • Das IRB/IEC hat Protokolländerungen genehmigt oder wurde darüber benachrichtigt.

      • Es werden genaue, vollständige und aktuelle Aufzeichnungen geführt und die Informationen aufgezeichnet.

      • Genaue, vollständige und zeitnahe Berichte über unerwünschte Ereignisse werden vorgelegt

      • Einverständniserklärung wurde eingeholt.

      • Der Grund für den Austritt eines Probanden aus der Studie wurde dokumentiert.

      • Dem IRB und dem Sponsor werden Berichte vorgelegt.

      • Das entsprechende Personal führt Studienaktivitäten durch.

      • Alle Fallberichtsformulare und andere Unterlagen im Zusammenhang mit der Studie werden nach Erhalt überprüft, und der Standort wird umgehend über etwaige Mängel informiert.

      Häufigkeit der Überwachungsbesuche a) Überwachungsbesuche werden gemäß Standardüberwachungsverfahren durchgeführt. Überwachungsbesuche werden auf der Grundlage mehrerer Faktoren festgelegt, darunter: b) Dauer der Studie; c) Zahl der offenen Probleme bei früheren Besuchen; d) Zahl der eingeschriebenen Fächer; e) Zahl der Untersucher/Standorte; und f) Komplexität der Studie.

      Beendigung der Studie Alle routinemäßigen Überwachungsfunktionen müssen vor dem Besuch zur Beendigung der Studie durchgeführt werden. Der Studienabschlussbesuch kann mit einem Überwachungsbesuch kombiniert werden. Die folgenden Aufgaben sollten beim letzten Besuch des Monitors erledigt werden.

   1. Erinnern Sie den Ermittler an die Verpflichtung, die Aufzeichnungen aufzubewahren. b) Erstellung des abschließenden Überwachungsberichts für IEC.

   Berichte über Überwachungsbesuche

   Für alle Besuche müssen Überwachungsberichte ausgefüllt werden. Berichte müssen die folgenden Informationen enthalten:

   a) Datum des Besuchs; b) Liste des anwesenden Personals des Studienzentrums; c) Eine Zusammenfassung der Ergebnisse, Probleme