Inyección intradiscal de plasma rico en plaquetas (PRP) enriquecido con exosomas en el dolor lumbar crónico

El manejo del dolor lumbar crónico (LBP) ha contribuido a su alto nivel socioeconómico. El disco intervertebral representa el 40% o más de los casos de LBP crónico. Las opciones de tratamiento disponibles no mejoran la condición degenerativa subyacente, aunque resuelven sus síntomas. Esto indica la necesidad de nuevas terapias y/o intervenciones que realmente traten las causas subyacentes del dolor discogénico. Las terapias biológicas mediante inyección directa de PRP en el anillo fibroso y núcleo pulposo parecen una opción efectiva y factible.

Los exosomas derivados de la sangre pueden transmitir potencialmente algunas de las propiedades únicas de las células madre a otras células madre, lo que facilita el mantenimiento, la diferenciación, la autorrenovación y la reparación de la troncalidad.

Proponemos tener un ensayo clínico controlado, aleatorizado y doble ciego para comparar la seguridad y la eficacia de los exosomas en el dolor lumbar. Se obtendrá el consentimiento informado de todos los sujetos antes de la participación en el estudio.

Preparación PRP:

La muestra de sangre (60 ml) se centrifugará a 600 × g durante 10 min para recoger la fracción de plasma. Y centrifugado a 4000×g por 15 min. A continuación, se eliminará el plasma pobre en plaquetas (PPP) sobrenadante, dejando 1 ml de PRP. La PPP se pasará a través de un filtro retrolavado especial diseñado por indígenas de una micra (Alpha Corpuscle, Delhi, India) para que todas las plaquetas presentes en la fracción de PPP queden atrapadas en el filtro. Estas plaquetas atrapadas se lavarán con 1 ml de PPP para recuperar la mayoría de las plaquetas. Esto se mezclará y luego se pasará a través de un filtro WBC (Terumo Imuguard, EE. UU.) para filtrar los leucocitos. El concentrado de PRP final (0,1 ml) se analizará para el recuento total de leucocitos y plaquetas. Se seleccionarán al azar cinco muestras tratadas con trombina bovina reconstituida en cloruro de calcio al 10 % y se evaluarán los factores de crecimiento [factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) y factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)] mediante ELISA.

En promedio, nuestra muestra de PRP tendrá 100 mil millones de plaquetas y un concentrado 30x de plaquetas sanguíneas en 2 ml de PRP final.

Preparación de exosomas:

Sesenta ml de sangre en tubos recubiertos con EDTA se centrifugarán a 1200 g durante 10 minutos a 4 °C para separar el plasma. El plasma se filtrará con un filtro (0,22 μm). Evite cualquier material granulado mientras transfiere el plasma. Deseche el material granulado. Este tubo tiene un filtro especial para concentrar exosomas y otras proteínas promotoras del crecimiento. El tubo se centrifugará a 3000 g, TA, 30 min y se recogerán los exosomas y luego se concentrarán (0,5 ml a 3 ml). Para recuperar los exosomas obstruidos en la pared del filtro, agregue 20 ml de NS (preferiblemente PBS) en un tubo de microcentrífuga y enjuáguelo por centrifugación a 3500 g. Recoja nuevamente la sopa concentrada de exosomas que estaban obstruidos en la pared del filtro.

La cuantificación del contenido de proteínas se realizará mediante el ensayo del ácido bicinconínico (BCA).

Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) Las suspensiones de vesículas con concentraciones entre 1 × 107/ml y 1 × 109/ml se examinarán utilizando un Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., Reino Unido) equipado con un láser de 405 nm para determinar el tamaño y la cantidad de partículas. aislado. Se tomará un video de 60 segundos de duración con una velocidad de cuadro de 30 cuadros por segundo y el movimiento de las partículas se analizará mediante el software NTA (versión 2.3; NanoSight Ltd.).

Análisis de transferencia Western El sobrenadante del exosoma se desnaturalizará en un tampón de muestra y se someterá a un análisis de transferencia Western. Los exosomas purificados se analizarán para la expresión de proteínas HSP70, flottilin, CD63, TSG101 y calnexin. Las proteínas se visualizaron en el sistema Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, EE. UU.).

Diseño del estudio Los pacientes serán aleatorizados en 2 brazos para recibir PRP con exosomas en el centro del núcleo pulposo o la misma cantidad de placebo y serán evaluados por 2 médicos intervencionistas de columna y medicina.

Aleatorización y brazos del estudio:

Aproximadamente 300 pacientes serán evaluados para asignarlos aleatoriamente a grupos de tratamiento o control en una proporción de 1:1, para asignar 30 pacientes a cada 4 brazos:

1. Se asignará el brazo I para recibir placebo (inyección en el punto gatillo debajo del brazo C)

2. Grupo II: para recibir PRP con exosomas en el centro del núcleo pulposo (2 ml) Producto(s) de prueba, dosis y modo de administración duración del tratamiento Los pacientes serán seleccionados aleatoriamente en función del número generado por computadora para recibir una inyección indistinguible de PRP ex o placebo. Después de la desinfección de la piel de la espalda, se inyectaron 2 ml del PRPex total obtenido lo antes posible mediante un abordaje lateral guiado por fluoroscopia. Los pacientes recibieron el placebo de manera similar pero no al disco. estará en la zona de los músculos alrededor del punto gatillo. El médico que evaluó el estudio y el paciente desconocían el tratamiento. Se aconsejó a los pacientes que continuaran con los ejercicios habituales, las precauciones de rutina, la fisioterapia y el cuidado de la espalda.

   Se permitirá el uso de paracetamol (hasta un máximo de un gramo) tres veces al día, como medicamento de rescate. Durante el estudio no se permitirá ningún corticoesteroide sistémico, fármaco/procedimiento que pueda modificar los síntomas.

   Evaluaciones del estudio/medidas de resultados

   1. Escala analógica visual (EVA)
   2. Cuestionario de discapacidad de Roland Morris (RDQ)
   3. Cuestionario de salud SF 36
   4. índice de calificación funcional

   5. IRM: clasificación de degeneración del disco, cuantificación T2 cualquier evidencia de discitis Los pacientes serán evaluados mediante escala analógica visual (VAS), cuestionario de salud SF 36, índice de calificación funcional al inicio y seguimiento a 1, 3, 6 y 12 meses. La eficacia estructural será evaluada por dos radiólogos experimentados mediante la cuantificación y clasificación de t2 de MRI como se describe anteriormente en la literatura al inicio y a los 6 meses. Los evaluadores estarán cegados.

      Las visitas de monitoreo se realizarán de acuerdo con los procedimientos de monitoreo estándar.

      Se comprobará la suspensión del tratamiento por un motivo concreto. Cualquier evidencia de infección/discitis será cuidadosamente observada. Se analizará profundamente el empeoramiento del dolor.

      Los pacientes serán evaluados para cualquier efecto adverso y signos vitales una vez a la semana durante el primer mes y luego una vez al mes hasta los 6 meses. Se recolectaron muestras de sangre al momento de ingresar al estudio, a los seis meses y en una visita final para examinar las variables biológicas, así como las funciones hepática y renal. Se evaluó la tolerabilidad y se realizaron ensayos hematológicos y bioquímicos de laboratorio. También se evaluará una posible relación causal con el brazo de tratamiento.

      ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

      Se utilizará el análisis de varianza (ANOVA) para investigar las diferencias entre los grupos. Las diferencias en muestras pareadas se compararán mediante la prueba t de Student de dos colas. Las correlaciones entre variables se evaluarán mediante la correlación de Pearson. Para los análisis estadísticos se utilizará SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE. UU.). P<0,05 se considerará estadísticamente significativo.

      Identificación de la relación entre los problemas de seguridad/efectos secundarios y el nivel de excitación mediante la medición por escalas de calificación. Para probar si la relación entre los problemas de seguridad/efectos secundarios y el nivel de excitación difiere entre los grupos de ACP/MCP de IBRF frente a los del estándar de atención, mediante la medición mediante escalas de calificación, se realizarán dos análisis. La correlación canónica se utilizará para determinar qué efecto secundario (o combinación de efectos secundarios) explica la variación en las mediciones de la escala de calificación. Además, se empleará el análisis de conglomerados para determinar si los efectos secundarios están relacionados de manera similar con los niveles de excitación y los resultados para los pacientes en los tres grupos de tratamiento.

      PROCEDIMIENTOS DE MONITOREO/EVENTOS ADVERSOS/PUNTOS FINALES DE SEGURIDAD Monitoreo Los monitores visitarán el centro durante el estudio además de mantener comunicación telefónica y escrita frecuente.

      Las siguientes pautas cumplen con los requisitos especificados en 21 CFR §812.46 y se proporcionan para describir los procedimientos para monitorear los estudios clínicos. Si el investigador no cumple con el Acuerdo del investigador firmado, el protocolo o cualquier condición del estudio (p. ej., formularios de datos incompletos), el monitor tiene derecho a cancelar la participación del investigador en el estudio.

      Procedimientos de seguimiento previos al estudio

      El designado (es decir, monitor) será responsable de determinar y documentar que cada investigador entiende claramente y acepta las responsabilidades y obligaciones contraídas en la realización de un estudio clínico. El monitor se asegurará antes del inicio del estudio de que el investigador:

      • Comprende los requisitos para un estudio bien controlado;

      • Comprende la naturaleza del protocolo clínico

      • Comprende sus obligaciones de presentación de informes;

      • Comprende los requisitos para la responsabilidad del dispositivo;

      • Comprende y acepta las obligaciones de obtener el consentimiento informado de acuerdo con 21 CFR Partes 50 y 56;

      • Comprende y acepta la obligación de obtener la revisión y aprobación del IRB de la investigación clínica antes de que se inicie y garantizar la revisión continua del estudio por parte del IRB de acuerdo con 21 CFR Parte 56, y mantener informado al patrocinador de todas las acciones del IRB relacionadas con el estudio;

      • Comprende y acepta los requisitos relacionados con la divulgación financiera de las investigaciones clínicas, 21 CFR Parte 54;
      • Tiene instalaciones adecuadas y acceso a un número adecuado de sujetos idóneos para llevar a cabo la investigación;
      • Tiene la documentación requerida en el archivo, incluida la aprobación del IRB y un acuerdo de investigador firmado.

      Visitas de control periódicas • Las visitas de control se realizarán de acuerdo con las Directrices de la FDA para el control de investigaciones clínicas, enero de 1988.

      • El monitor debe visitar cada sitio regularmente para asegurarse de lo siguiente:

      • Las instalaciones continúan siendo adecuadas y aceptables.

      • El protocolo se está siguiendo correctamente.

      • El IRB/IEC ha aprobado o ha sido notificado de cualquier cambio de protocolo.

      • Se mantienen registros precisos, completos y actualizados, y se registra la información.

      • Se están enviando informes de eventos adversos precisos, completos y oportunos.

      • Se ha obtenido el consentimiento informado.

      • Se ha documentado el motivo del retiro de un sujeto del estudio.

      • Los informes se están enviando al IRB y al patrocinador.

      • El personal adecuado está realizando las actividades de estudio.

      • Todos los formularios de informes de casos y otra documentación relacionada con el estudio se revisarán una vez recibidos, y se notificará de inmediato al centro sobre cualquier deficiencia.

      Frecuencia de las visitas de control a) Las visitas de control se realizarán de acuerdo con los procedimientos de control estándar. Las visitas de monitoreo se determinarán sobre la base de varios factores, entre ellos: b) Duración del estudio; c) Número de temas pendientes de visitas anteriores; d) Número de sujetos matriculados; e) Número de investigadores/sitios; y, f) Complejidad del estudio.

      Terminación del estudio Todas las funciones de monitoreo de rutina deben realizarse antes de la visita de terminación del estudio. La visita de finalización del estudio puede combinarse con una visita de control. Las siguientes tareas deben completarse en la última visita del monitor.

   1. Recuerde al investigador la obligación de conservar los registros. b) Preparar informe final de seguimiento para IEC.

   Informes de Visitas de Monitoreo

   Los informes de seguimiento deben completarse para todas las visitas. Los informes deben incluir la siguiente información:

   a) Fecha de la visita; b) Lista del personal del sitio de estudio presente; c) Un resumen de los hallazgos, problemas