Intra-diskal injeksjon av blodplaterikt plasma (PRP) beriket med eksosomer ved kroniske korsryggsmerter

Håndtering av kroniske korsryggsmerter (LBP) har bidratt til dens høye sosioøkonomiske. Intervertebralskiven står for 40 % eller flere tilfeller av kronisk LBP. Tilgjengelige behandlingsalternativer forbedrer ikke den underliggende degenerative tilstanden, selv om de løser symptomene. Dette indikerer behovet for nye terapier og/eller intervensjoner som faktisk behandler de underliggende årsakene til diskogen smerte. Biologiske terapier ved direkte injeksjon av PRP i annulus fibrosus og nucleus pulposus synes å være et effektivt og gjennomførbart alternativ.

Eksosomer avledet fra blod kan potensielt overføre noen av de unike stamcelleegenskapene til andre stamceller, noe som letter vedlikehold, differensiering, selvfornyelse og reparasjon.

Vi foreslår å ha en kontrollert, randomisert, dobbeltblind klinisk studie for å sammenligne sikkerheten og effekten av eksosomer i LBP. Informert samtykke vil bli innhentet fra alle fag før studiedeltakelse.

PRP-forberedelse:

Blodprøve (60 ml) vil bli sentrifugert ved 600×g i 10 minutter for å samle plasmafraksjon. Og sentrifugert ved 4000×g i 15 min. Supernatant blodplatefattig plasma (PPP) vil deretter bli fjernet, og etterlater 1 ml PRP. PPP vil bli ført gjennom ett-mikrons spesialdesignet urfolksfilter (Alpha Corpuscle, Delhi, India) slik at alle blodplater som er tilstede i PPP-fraksjonen vil bli fanget i filteret. Disse fangede blodplatene vil skylles tilbake med 1 ml PPP for å hente ut de fleste blodplatene. Dette vil bli blandet sammen og deretter ført gjennom et WBC-filter (Terumo Imuguard, USA) for å filtrere bort leukocyttene. Det endelige PRP-konsentratet (0,1 ml) vil bli analysert for totalt antall leukocytter og blodplater. Fem prøver vil bli valgt tilfeldig behandlet med bovint trombin rekonstituert i 10 % kalsiumklorid vil bli vurdert for vekstfaktorer [blodplateavledede vekstfaktorer (PDGF) og vaskulære endoteliale vekstfaktorer (VEGF)] ved ELISA.

I gjennomsnitt vil vår PRP-prøve ha 100 milliarder blodplater og 30x konsentrat av blodplater i 2 ml endelig PRP.

Eksosom forberedelse:

Seksti ml blod i EDTA-belagte rør vil spinnes ved 1200 g i 10 minutter ved 4°C for å skille plasma. Plasma vil bli filtrert med (0,22 μm) filter. Unngå pelletert materiale under overføring av plasma. Kast det pelleterte materialet. Dette røret har et spesielt filter for å konsentrere eksosomer og andre vekstfremmende proteiner. Røret vil bli sentrifugert ved 3000 g, RT, 30 minutter og eksosomer vil bli samlet og deretter konsentrert (0,5 ml til 3 ml). For å gjenvinne eksosomer som er tilstoppet i filterveggen - tilsett 20 ml NS (fortrinnsvis PBS) i mikrosentrifugerøret og skyll det ved sentrifugering ved 3500 g. Samle opp den konsentrerte suppen av eksosomer igjen som var tilstoppet i filterveggen.

Kvantifisering av proteininnhold vil bli gjort ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA) assay.

Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) Vesikkelsuspensjoner med konsentrasjoner mellom 1×107/ml og 1×109/ml vil bli undersøkt med en Nanosight NS300 (NanoSight Ltd., UK) utstyrt med en 405 nm laser for å bestemme størrelsen og mengden av partikler isolert. En video med en varighet på 60 sekunder vil bli tatt med en bildefrekvens på 30 bilder/sek, og partikkelbevegelsen vil bli analysert ved hjelp av NTA-programvare (versjon 2.3; NanoSight Ltd.).

Western blot-analyse Eksosom-supernatanten vil bli denaturert i prøvebuffer og vil bli utsatt for Western blot-analyse. Rensede eksosomer vil bli analysert for proteinekspresjon HSP70, flottilin, CD63, TSG101 og calnexin. Proteinene ble visualisert på Bio-Rad ChemiDoc XRS Imager-systemet (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, CA, USA).

Studiedesign Pasienter vil bli randomisert i 2 armer med enten å motta PRP med eksosomer i sentrum av nucleus pulposus eller like mye placebo og vil bli evaluert av 2 intervensjonelle ryggrads- og medisinleger.

Randomisering og armer av studien:

Omtrent tre hundre pasienter vil bli screenet for å tilfeldig fordeles til behandlings- eller kontrollgrupper i forholdet 1:1, for å tildele 30 pasienter i hver 4-arm:

1. Arm Jeg vil bli tildelt placebo (triggerpunktinjeksjon under C-armen)

2. Arm II: for å motta PRP med eksosomer i sentrum av nucleus pulposus (2ml) Testprodukt(er), dose og administrasjonsmåte varighet av behandlingen Pasienter vil bli tilfeldig valgt basert på datamaskingenerert nummer for å motta én utskillelig injeksjon av PRP ex. eller placebo. Etter huddesinfeksjon av ryggen ble 2 ml av den totale PRPex som ble anskaffet injisert så snart som mulig ved hjelp av en fluoroskopiveiledet lateral tilnærming. Pasienter mottok placebo på lignende måte, men ikke til disk vil være i muskelsonen rundt triggerpunktet. Legen som evaluerte studien og pasienten var ukjent for behandling. Pasientene ble rådet til å fortsette med vanlige øvelser, rutinemessige forholdsregler, fysioterapi og ryggpleie.

   Paracetamol (maksimalt inntil ett gram) tre ganger daglig vil tillates brukt som redningsmiddel. Ingen systemisk kortikosteroid, potensielt symptommodifiserende legemiddel/prosedyre vil bli tillatt under studien.

   Studievurderinger / Resultatmål

   1. Visuell analog skala (VAS)
   2. Roland Morris Disability Questionnaire (RDQ)
   3. SF 36 helsespørreskjema
   4. Funksjonell vurderingsindeks

   5. MR - gradering av skivedegenerasjon, T2-kvantifisering alle tegn på diskitt Pasienter vil bli vurdert ved hjelp av visuell analog skala (VAS), SF 36 helsespørreskjema, funksjonell vurderingsindeks ved baseline og fulgt etter 1, 3, 6 og 12 måneder. Den strukturelle effekten vil evalueres ved MR t2 kvantifisering og gradering som beskrevet tidligere i litteraturen ved baseline og etter 6 måneder av to erfarne radiologer. Bedømmere vil bli blendet.

      Overvåkingsbesøk vil bli gjennomført i henhold til standard overvåkingsprosedyrer.

      Seponering av behandling med en bestemt årsak vil bli konstatert. Eventuelle tegn på infeksjon/diskitt vil bli nøye observert. Forverring av smerte vil bli grundig analysert.

      Pasientene vil bli evaluert for eventuelle bivirkninger og vitale tegn en gang i uken den første måneden og deretter en gang i måneden i opptil 6 måneder. Blodprøver ble tatt på tidspunktet for inntreden i studien, etter seks måneder, og ved et siste besøk for å undersøke biologiske variabler samt lever- og nyrefunksjoner. Tolerabilitet ble vurdert og laboratoriebaserte hematologiske og biokjemiske analyser ble utført. En mulig årsakssammenheng med behandlingsarmen vil også bli vurdert.

      STATISTISK ANALYSE:

      Variansanalyse (ANOVA) vil bli brukt for å undersøke forskjellene mellom grupper. Forskjeller i parvise prøver vil bli sammenlignet ved å bruke den to-halede studentens t-test. Korrelasjoner mellom variabler vil bli vurdert ved Pearsons korrelasjon. SPSS 20.0 vil bli brukt til statistiske analyser (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0,05 vil anses å være statistisk signifikant.

      Identifisering av sammenhengen mellom sikkerhetsproblemer/bivirkninger og opphisselsesnivå ved hjelp av måling ved vurderingsskalaer. For å teste om forholdet mellom sikkerhetsproblemer/bivirkninger og opphisselsesnivå er forskjellig mellom IBRF ACP/MCP vs Standard of Care-grupper, ved hjelp av måling ved hjelp av vurderingsskalaer, vil to analyser bli utført. Kanonisk korrelasjon vil bli brukt for å bestemme hvilken bivirkning (eller kombinasjon av bivirkninger) som forklarer variasjonen i vurderingsskalamålingene. I tillegg vil klyngeanalyse bli brukt for å bestemme om bivirkninger er tilsvarende relatert til opphisselsesnivåer og utfall for pasienter i de tre behandlingsgruppene.

      OVERVÅKNINGSPROSEDYRER/BIVIRKNINGER / SIKKERHETSENDEPUNKTER Overvåking Monitorene vil besøke senteret under studien i tillegg til å opprettholde hyppig telefonisk og skriftlig kommunikasjon.

      Følgende retningslinjer oppfyller kravene spesifisert i 21 CFR §812.46 og er gitt for å beskrive prosedyrene for overvåking av de kliniske studiene. Hvis etterforskeren ikke overholder den undertegnede etterforskeravtalen, protokollen eller en hvilken som helst betingelse for studien (f.eks. ufullstendige dataskjemaer), har monitoren rett til å avslutte etterforskerens deltakelse i studien.

      Overvåkingsprosedyrer for forstudie

      Utpekeren (dvs. monitor) vil være ansvarlig for å fastslå og dokumentere at hver etterforsker tydelig forstår og aksepterer ansvaret og forpliktelsene som pådras ved å gjennomføre en klinisk studie. Monitoren vil sikre før studiestart at etterforskeren:

      • Forstår kravene til en godt kontrollert studie;

      • Forstår arten av den kliniske protokollen

      • Forstår hans/hennes rapporteringsplikter;

      • Forstår kravene til enhetsansvarlighet;

      • Forstår og aksepterer forpliktelsene til å innhente informert samtykke i samsvar med 21 CFR Parts 50 and 56;

      • Forstår og aksepterer forpliktelsen til å innhente IRB-gjennomgang og godkjenning av den kliniske undersøkelsen før den settes i gang og sikre kontinuerlig gjennomgang av studien av IRB i samsvar med 21 CFR Part 56, og å holde sponsoren informert om alle IRB-handlinger vedrørende studien;

      • Forstår og aksepterer kravene til finansiell avsløring av kliniske undersøkelser, 21 CFR Part 54;
      • har tilstrekkelige fasiliteter og tilgang til et tilstrekkelig antall egnede emner for å gjennomføre etterforskningen;
      • Har nødvendig dokumentasjon, inkludert IRB-godkjenning og en signert etterforskeravtale.

      Periodiske overvåkingsbesøk • Overvåkingsbesøk vil bli utført i samsvar med FDAs retningslinjer for overvåking av kliniske undersøkelser - januar 1988.

      • Monitoren bør besøke hvert sted regelmessig for å sikre følgende:

      • Fasilitetene fortsetter å være tilstrekkelige og akseptable.

      • Protokollen følges på riktig måte.

      • IRB/IEC har godkjent eller blitt varslet om protokollendringer.

      • Nøyaktige, fullstendige og aktuelle journaler blir opprettholdt, og informasjonen registreres.

      • Nøyaktige, fullstendige og rettidige rapporter om bivirkninger sendes inn

      • Informert samtykke er innhentet.

      • Årsaken til at en forsøksperson trekker seg fra studien er dokumentert.

      • Rapporter sendes til IRB og sponsor.

      • Det aktuelle personalet utfører studieaktiviteter.

      • Alle saksrapportskjemaer og annen dokumentasjon knyttet til studien vil bli gjennomgått ved mottak, og stedet vil umiddelbart bli varslet om eventuelle mangler.

      Hyppighet av overvåkingsbesøk a) Overvåkingsbesøk vil bli utført i henhold til standard overvåkingsprosedyrer. Overvåkingsbesøk vil bli bestemt på grunnlag av flere faktorer, inkludert: b) Studiens varighet; c) Antall utestående problemer fra tidligere besøk; d) Antall påmeldte fag; e) Antall etterforskere/lokaliteter; og, f) Studiens kompleksitet.

      Studieavslutning Alle rutinemessige overvåkingsfunksjoner må utføres før studieavslutningsbesøket. Studieavslutningsbesøket kan kombineres med et overvåkingsbesøk. Følgende oppgaver skal fullføres ved siste besøk av monitoren.

   1. Minn etterforskeren om plikten til å oppbevare journalene. b) Utarbeide endelig overvåkingsrapport for IEC.

   Rapporter om overvåkingsbesøk

   Overvåkingsrapporter skal fylles ut for alle besøk. Rapporter må inneholde følgende informasjon:

   a) Dato for besøket; b) Liste over personell på studiestedet til stede; c) En oppsummering av funnene, problemene